电子显微技术在医学昆虫学中的应用

电子显微技术在医学昆虫学中的应用_医学昆虫学

电子显微技术（electron microscope technique）作为20世纪的重大发明之一，目前已广泛应用于生物医学领域，常用的有透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）。不仅可用于形态学分析，还可结合图像处理、元素分析、三维重构等分析技术为生命科学及临床医学研究提供必要的数据依据，是目前医学昆虫学、生理学、病理学、细胞生物学、组织胚胎学等学科不可缺少的研究方法和技术。

（一）电镜成像原理

1．透射电镜技术　透射电镜是将电子束透过样品经聚焦与放大后产生物像，投射到荧光屏或照相底片上进行观察。目前，主流的透射电镜镜筒是由电子枪室、6～8级成像透镜及观察室等组成。在灯丝加热电流作用下，阴极灯丝发射电子束，并在阳极加速高压的加速下向下高速运动，经第一聚光镜及第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再经物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。其总放大倍数为四级放大透镜各级放大倍数的乘积（几万至几十万倍）。透射电镜可获得高分辨率（0．1～0．2nm）的超微结构图像，但因电子易散射或被物体吸收，其穿透力低，故透镜所观察的样品必须是很薄切片（通常为50～100nm）。

2．扫描电镜技术　扫描电镜基本部件有透镜系统、电子枪、电子收集器、观察与记录用的阴极射线管（CRTs）及相关电子装置。主要运用二次电子成像原理，其电子枪发射出电子经由聚光镜和物镜组成的电子光学系统聚集成极细的电子束，以光栅状扫描方式对样品表面进行扫描，用检出器收集样品表面发射出的二次电子，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。

（二）电镜样品的制备

无论是透射电镜（TEM），还是扫描电镜（SEM），均是在高真空条件下使电子束与样品相互作用而获取各种图像信息。因此，电镜样品要求能够耐受高倍率、高能量电子束的轰击，能够耐受高真空度下的蒸发，要求良好的导电性能。对于导电性差的生物样品（或者其他非导体），必须采取导电措施。常用导电染色及样品表面喷镀或者溅射导电膜等方法处理。

1．透射电镜的生物样品制备　制备超薄切片是透射电镜技术的关键，也是一项最基本和最常用的技术。超薄切片的制作过程较复杂，其原理及制作过程大体上与光学显微镜的石蜡切片相仿，要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小（＜1mm3），常用戊二醛和锇酸进行双重固定树脂包埋，用特制的超薄切片机（ultramicrotome）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。超薄切片需经取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片以及染色等常规步骤：①醛类预固定2～4h；②缓冲液清洗几次，其间更换新的缓冲液；③锇酸后固定；④缓冲液清洗半小时以上；⑤乙醇或丙酮的上升系列脱水，其顺序为50%，70%，80%，90%，95%各1次，每次5～15min，100%2～3次，每次5～15min；⑥包埋剂浸透，包埋；⑦聚合，60℃下聚合24～36h，或者在紫外线下聚合24～48h；⑧超薄切片；⑨染色。

2．扫描电镜的生物样品制备　扫描电镜样品制备方法较超薄切片简单，样品用戊二醛和锇酸等固定，经脱水和临界点干燥后，再喷镀薄层金膜于样品表面，以增加二次电子数。需经取材、清洗、固定、脱水、干燥及被覆导电膜等基本步骤：①取材：选取目的组织，暴露并清洗观察表面；②固定：采用物理或化学方法固定组织，减少不必要的流失；③脱水：采用丙酮、乙醇类有机溶剂按其梯度浓度进行脱水；④干燥：对某些坚硬、衰老或死亡样品可采用操作简便的自然干燥法，物理方法是目前应用的最主要方法，其中临界点干燥、冷冻干燥应用得相当广泛；⑤导电处理：常规的被覆金属膜已被证实能够在相当高分辨率条件下获得理想的图像。

（三）在医学昆虫学中的应用

我国于1958年成功地研制了第一台电子显微镜。随着计算机技术的快速发展，电子显微技术日益进步，其放大倍数已超过1　000多万倍，并在生物学、医学、材料科学等领域得到广泛应用。应用电镜技术研究昆虫的超微形态结构，对于昆虫分类学、昆虫生理学、昆虫病理学等基础学科及昆虫利用、防治等具有重要意义。目前，电子显微镜技术已成为研究昆虫微细结构的重要手段。

秦志辉、李朝品等（1998）用扫描电子显微镜和解剖显微镜对刺蛾幼虫体表着生的毒刺和刚毛进行观察，结果显示：刺蛾幼虫体表着生枝刺，其中背刺11对，体刺9对，毒刺可分为箭刺、鞭刺、棒状刺、锥状刺、针状刺五种类型，并讨论了毒刺与致病性的关系。任树芝等（1990）对我国半翅目异翅亚目陆栖组中10科30余属50多种蝽类卵的破卵器在扫描电镜下进行观察比较，将陆栖组蝽类卵的破卵器分为蝽型、缘蝽型及臭虫型三种类型，并对前两种类型破卵器形态及细微构造特征进行对比，研究了破卵器在属、种间的差异，为系统分类、胚胎发育及细微形态特征等方面提供新的依据。

电子显微技术作为生物医学界应用最广泛的科学研究工具之一，为人类探索微观世界创造了条件，随着科学技术的进步，显微镜的类型和用途也在不断更新和发展中，可以预测，电子显微技术的快速发展必将为医学昆虫学超微结构的研究带来新的契机。

（陶　莉杨庆贵）

参考文献

1　陈吉刚，郑肖娟，龚　辉，等．RNA干扰研究进展，中国预防兽医学报，2004；26（2）：155

2　陈兴保主编．病原生物学和免疫学．北京：人民卫生出版社，2004，1－81

3　陈其津，李广宏，林扬帆．杀虫剂毒力测定数据的快速运算与分析．中山大学学报论丛．2001；21（3）：39 4　陈苏民．丝状噬菌体表面呈现技术．国外医学分子生物学分册，1994；16（5）：193

5　成新跃，周红章，张广学．分子生物学技术在昆虫系统学研究中的应用．动物分类学报，2000；25（2）：121

6　戴大临，张清敏主编．生物医学电镜样品制备方法．天津：天津大学出版社，1993；1－257

7　邓　宁，陈曲侯，洪华珠，等．昆虫细胞大规模培养和杆状病毒的生产．昆虫知识．1995；32（4）：236

8　郭亚平，郑莉，马思波，等．蝗虫染色体C带带型示意图的计算机绘制．遗传．1997；9（6）：30

9　胡友兰，李国清．荒川库蠓rDNA ITS2的序列测定与分析．动物学报，2003；49（2）：277

10　李朝品主编．临床免疫学．北京：人民军医出版社，2004：1－214

11　李朝品．人体寄生虫学．合肥：中国科学技术大学出版社，1991：1－165

12　李石柱，马雅军，郑哲民．应用PCR－SSCP鉴别我国多斑按蚊复合体成员种．昆虫分类学报，2003；25（2）：125

13　李士根，蒋滨，秦建中，等．微板法测定淡色库蚊体内非特异性酯酶检测其对杀虫剂抗性的研究．中国人兽共患病杂志，2002；18（5）：72

14　廖乾初，蓝芬兰主编．扫描电镜原理及应用技术．北京：冶金工业出版社，1990：1－331

15　刘群红，李朝品主编．现代生物技术概论．北京：人民军医出版社，2005：1－329

16　刘先凯，赵彤言，朱礼华，等．白纹伊蚊和埃及伊蚊defensin A基因克隆及序列分析．寄生虫与医学昆虫学报，2002；9（4）：216

17　秦志辉，韩玉敏，李朝品．致病性刺蛾幼虫及其毒刺的形态观察．中国寄生虫病防治杂志，1998；11（3）：217

18　任树芝，郭淑华，周杏弟．蝽类昆虫破卵器扫描电镜观察．昆虫学报，1990；33（2）：189

19　宋社吾，赵彤言，董言德．Wolbachia在我国蚊虫体内感染组织定位的透射电镜观察和PCR检测，寄生虫与医学昆虫学报，2002；9（1）：26

20　孙红英，张锡然，苏翠荣，等．蜉蝣目昆虫染色体制备方法探讨．动物学杂志，1998；33（2）：30

21　孙　新，李朝品，张进顺主编．实用医学寄生虫学．北京：人民卫生出版社，2005：1－657

22　田海生，朱昌亮，高晓红，等．淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因克隆和序列分析．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001；19（4）：193

23　王绪勇，瞿逢伊．蚊虫胃血血源鉴定方法简介．四川动物．1980；8（4）：32

24　王　瑛，陈晓峰．基因探针及其在昆虫学上的应用．生物工程进展，1996；16（3）：28

25　魏晓棠，权洁霞，张艺兵．分子生物学技术在昆虫早期鉴定中的应用前景．检验检疫科学，2003；13（2）：19

26　闫守庆，张玉静．噬菌体表面呈现技术及在疫苗研制中的应用．黑龙江医学，2003；27（2）：110

27　曾晓芃，薛素琴，付学锋．德国小蠊抗药性检测方法比较研究．中国媒介生物学及控制杂志，2004；15（1）：17

28　赵　佼，戴　琥，谭文松．转瓶内部结构对无血清悬浮培养昆虫细胞的影响．生物工程学报，2000；16（6）：755

29　赵素然，祁忠占，白艳玲．介绍一种摇蚊唾腺染色体永久封片的制作方法．生物学通报，2005；40（6）：49

30　朱淮民，邹亚丁．反义核酸抑制抗敌百虫淡色库蚊扩增酯酶mRNA体外翻译的研究．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001；19（6）：333

31　朱　翔，蓝明扬．埃及伊蚊细胞系（Aaegl289）染色体G带研究．苏州医学院学报，1995；15（1）：53

32　Ardila A，Escovar J，Bello F．Characteristics of new cell cultures derived from embryonic tissues of Aedes aegypti Biomedica．2005；25（1）：65

33　Benedict，M．Q，Cockbum AF，et al．The Hsp70 heat－shock gene family of the mosquito Anopheles al－bimanus Insect Mol．Biol，1993；2（2）：92

34　Blanchetot，A．＆Gooding，R．H．Genetic analsis by DNA fingerprinting in tsetse fly genomes．Insect Biochem．Mol．Biol；1993；23（8）：937

35　Boutla A，Delidakis C，Tabler M．Developmental defects by antisense－mediated inactivation of micro－RNAs　2and　13in Drosophila and the identification of putative target genes．Nucleic Acids Res，2003；31（17）：4973

36　Chen H，Wang J，Liang P，et al．Microarray analysis for identification of Plasmodium－refractoriness candidate genes in mosquitoes．Genome，2004；47（6）：1061

37　Ghosh AK，Moreira LA，Jacobs－Lorena M．Plasmodium－mosquito interactions，phage display libraries and transgenic mosquitoes impaired for malaria transmission．Insect Biochem Mol Biol，2002；32（10）：1325

38　Hiss，R．H．，D．E．Norris，C．H．Dietrich et al．Molecular taxonomy using single strand conformation polymorphism（SSCP）analysis of Mitochondrial ribosomal DNA genes．Insect Mol．Biol，1994；3：171

39　Howland DE，Hewitt GM．Phylogeny of the Coleoptera based on mitochondrial cytochrome oxidase I sequence data．Insect Mol Biol，1995；4（3）：203

40　Kumar，V．，Collins，F．H．A technique for nucleic acid in situ hybridization to polytene chromosomes of mosquitoes in the Anopheles gambiae complex，Insect Mol，Biol，1993；3（1）：41

41　Langor DW，Sperling FA．Mitochondrial DNA sequence divergence in weevils of the Pissodes strobi species complex（Coleoptera：Curculionidae）．Insect Mol Biol，1997；6（3）：255

42　Litjens P，Lessinger AC，de Azeredo－Espin AM．Characterization of the screwworm flies Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria by PCRRFLP of mitochondrial DNA．Med Vet Entomol，2001；15（2）：183

43　Reiss，R．A．，James，A．A．A glutaghione S－transferase gene of the vector mosquito，Anopheles gambiae．Insect Mol．Biol，1993，2（1）：25

44　Salazr，CE，Hamm DM，Wesson DM，et al．A cytoskeletal actin gene in the mosquito Anopheles gambiae．Insect Mol，Biol，1994；3（1）：1

45　Shanmugavelu M，Baytan AR，Chesnut JD，et al．A novel protein that binds juvenile hormone esterase in fat body tissue and pericardial cells of the tobacco hornworm Manduca sexta L．J Biol Chem，2000；275（3）：1802

46　Shotkoski，F，Lee HJ，Zhang HG，et al．Functional expression of insexticide－resistant GABA receptors from the mosquito Aedes acgeypti．Insect Mol．Biol，1994；3（4）：283

47　Tavernarakis N，Wang S L，Dorovkov M，et al．Heritable and inducible genetic interference by double－stranded RNA encoded by transgenes．Nat Genet，2000；23（2）：180

48　Tungtrongchitr A，Sookrung N，Munkong N．The levels of cockroach allergen in relation to cockroach species and allergic diseases in Thai patients．Asian Pac J Allergy Immunol，2004；22（2－3）：115

49　Yuan W Z，Bodmer R，Zhu C B，et al．The use of RNAi as a technique to study the functions of heartrelated genes in Drosophila．Yi Chuan Xue Bao，2002；29：34