反义核酸技术在医学昆虫学中的应用

反义核酸（antisense oligonucleotide）是指能与特定mRNA精确互补、特异性阻断其翻译的RNA或DNA分子。根据核酸杂交原理，设计针对特定靶序列反义核酸，使其特异地抑制或封闭某些基因的表达，这种技术即为反义核酸技术。

（一）基本原理

反义核酸包括反义RNA、反义DNA及核酶（ribozyme），其作用机制均不同。

1．反义RNA　是指能对结构基因表达起调节作用的RNA，可分为三类。Ⅰ类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和（或）编码区，引起翻译的直接抑制（ⅠA类）或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解（ⅠB类）；Ⅱ类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能；Ⅲ类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。

2．反义DNA　即反义寡核苷酸，是指能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录和翻译的短链脱氧核苷酸。反义DNA在细胞质和细胞核中均能发挥作用。在细胞质中，反义DNA和mRNA形成杂交体阻断核糖体与mRNA结合，或促进RNA酶H定点切割RNA，阻止mRNA的翻译。反义DNA能穿过核膜，因此在细胞核中可与前体mRNA甚至和DNA上的互补序列结合，从而干扰转录剪接或成熟转录物质运输至细胞质。

3．核酶　核酶是具有酶催化活性的RNA，主要参与RNA的加工与成熟，有锤头状和发夹状两种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成。两个臂序列高度保守，与靶RNA特异互补结合，相当于一种反义RNA，功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA，核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构，裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体（X：C、U、A）下游方向即3＇端。

（二）基本过程

反义核酸可通过人工合成和生物合成获得。

1．反义RNA的构建和转染　反义RNA可以用化学法或酶法人工合成，也可利用重组DNA技术从反义表达载体中产生。载体可为病毒、质粒及脂质体。然后通过显微注射法或共转染法转染细胞，使特定基因表达。

2．反义DNA的构建和应用　人工构建的反义DNA大多经化学修饰，以硫代磷酸酯（PS）修饰的ODNs较多，可以防止核酸内切酶的作用。反义DNA进入细胞方法主要为胞饮作用。但PSODN等不易透过细胞膜，因此常通过脂质体包埋、胆酯共聚物、PEG共聚物等与其形成复合体，利于细胞的摄取。

3．核酶的构建和合成　根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆于SP6或T7等启动子下游，通过转录合成所需核酶。核酶能特异切割RNA分子，阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能。

（三）在医学昆虫学中的应用

近年来分子生物学技术的突飞猛进为医学昆虫学的研究提供了许多新的技术途径，反义核酸技术即为其中的新兴技术之一，有其独到优点：①在尚未探明其副作用的前期研究阶段，通过体外合成反义核酸并运送至靶细胞起作用，只产生短期效应，不会留下长久的遗传效应，有较好的安全性。②反义核酸的用量及靶序列的作用环节可以人为控制。③精确设计的反义核酸序列原则上不会干扰其他基因结构及其自身正常的调控方式。④无法敲除坏基因时，可采用反义核酸技术。

反义核酸技术自20世纪80年代诞生以来，作为一种基因下调作用因子，在抑制某些有害基因表达和失控基因过度表达上发挥了重要作用，随着该技术的发展和成熟，已在很多研究领域中得到应用，医学昆虫学研究领域也不例外。

朱淮民等（2001）人工合成互补于抗性库蚊酯酶mRNA翻译起始点的18bp寡脱氧核苷酸，与淡色库蚊mRNA退火，进行体外无细胞翻译，翻译产物用SDS－PAGE进行分析。结果显示，6μmol／L ODNs可抑制50%特异性酯酶翻译量，20μmol／L ODNs可抑制80%特异性酯酶翻译量。电泳结果显示条带浓度接近敏感蚊虫所表达的酯酶量。该研究成果表明，针对抗敌百虫淡色库蚊扩增酯酶mRNA翻译起始点的反义核酸在体外能有效地抑制其mRNA的翻译。

Boutla A等（2003）在果蝇胚胎中显微注射不同的微RNA特异的DNA反义核酸，观察了4例果蝇胚胎，发现可严重干扰果蝇正常发育，并进一步在cDNA文库摸板中用miR－13aDNA反义核酸作为引物进行PCR，辨认了9种果蝇基因，它们以3′端非翻译区miR－13或相关微RNA缺陷双链结构基序为特征。

反义核酸技术在医学昆虫学领域中的应用才刚刚起步，其安全性问题仍然是科学家们关注的焦点。但有理由相信，随着反义核酸技术作用机制的进一步探明，成本的进—步降低，该技术在医学昆虫学研究领域中必将具有很好的应用前景。