血清尿素测定（脲酶－波氏比色法）

实验四　血清尿素测定（脲酶－波氏比色法）

【教学目标】

（1）了解用脲酶－波氏比色法测定血清尿素的原理。

（2）掌握血清尿素测定的操作技术及临床意义。

【实验原理】

尿素在脲酶的催化下产生1分子CO₂和2分子NH₃。在碱性条件下，以亚硝基铁氰化钠为催化剂，NH3与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量呈正比。与同样处理的尿素标准比较，即可求得血清样品中尿素的含量。

【试剂】

（1）酚显色剂：称取苯酚10g、亚硝基铁氰化钠（含2分子水）0．05g，溶于1L无氨去离子水中，存放于4℃中可保存2个月。

（2）碱性次氯酸钠溶液：称取氢氧化钠5g，溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8 mL（相当于次氯酸钠0．42g），用去离子水定容至1L。置于棕色瓶内，4℃时可保存2个月。

（3）脲酶储存液：取脲酶（比活性3000～4000U/g）1g置于20mL 50%（V/V）甘油中，4℃时可保存6个月。

（4）脲酶应用液：取脲酶储存液1mL，加10g/L的pH 6．5的EDTA－Na₂溶液至100mL，4℃时保存可稳定1个月。

（5）尿素标准储存液（100mmol/L）：精确称取60～65℃干燥恒重的尿素（Mw为60．06）0．6g，溶于无氨去离子水中定容至100mL，加0．1g叠氮钠防腐，4℃时可保存6个月。

（6）尿素标准应用液（5mmol/L）：取尿素标准储存液5mL，用无氨去离子水稀释至100mL。

【器材】

试管、试管架、加样器、722型分光光度计、刻度吸管、恒温水浴箱。

【操作】

取三支试管，按实验表4－1操作。

实验表4－1　血清尿素测定（脲酶－波氏比色法）操作步骤

续表

取出各管，在波长560nm处，以空白管调零，用722型分光光度计读取标准管和测定管的吸光度。

【计算】

【参考范围】

血清尿素含量为1．78～7．14mmol/L。

【临床意义】

血清尿素含量增高：急性或慢性肾炎、重症肾盂肾炎、各种原因所致的急性或慢性肾功能障碍，心肌衰竭、休克、烧伤、失水、大量内出血、肾上腺皮质功能减退症、前列腺肥大、慢性尿路梗阻等。

【注意事项】

（1）由于本实验中相关试剂均应用无氨去离子水配制，其中的氨可能会影响测定结果，使结果偏高。

（2）空气中氨对试剂或玻璃器皿的污染可使结果偏高，使用铵盐抗凝剂也可使结果偏高。

（3）若用血浆测定尿素氮时应避免用高浓度氟化物、草酸盐作抗凝剂，因其能抑制尿素酶活性，引起结果假性偏低。

（4）本法也能测定尿液中的尿素，但须将尿液稀释并去除尿中的游离铵盐。具体方法如下。1．0mL尿标本，加入人造沸石（需预处理）0．5g，加去氨蒸馏水至25mL，反复振摇数次，吸附尿中游离铵盐，静置后吸取稀释尿液1．0mL。按上述操作方法进行测定，结果乘以稀释倍数25。

【思考题】

（1）试剂、空气中的氨及使用铵盐抗凝剂为什么会导致测定结果偏高？

（2）血清尿素测定为什么可以作为肾功能的评价实验？

（王易振）