血清尿素氮测定（脲酶—比色法）

实验十二　血清尿素氮测定（脲酶—Berthelot比色法）

一、实验目的与要求

1．了解血液尿素氮（BUN）在人体营养学上的生理学意义及其在代谢上的重要性。

2．掌握血液尿素氮测定方法及721分光光度计或AT－648半自动生化多用仪的使用方法和现代生化检测试剂盒的应用。

二、实验原理

尿素在脲酶作用下分解生成氨。碱性条件下，要在亚硝基铁氰化钠催化作用下与苯酚及次氯酸反应，生成蓝色的吲哚酚，550nm波长比色，蓝色吲哚酚的生成量与尿素氮含量成正比。其反应式为：

三、实验仪器与试剂

1．仪器

（1）AT－648半自动生化分析仪1台；

（2）4孔恒温水浴锅1个；

（3）振动摇床1台。

2．分组及仪器　2人一组，每组仪器包括：

（1）试管架1个；

（2）2ml试管10个；

（3）20μl微量加样器1个；

（4）1ml移液管1个；

（5）5ml移液管2个；

（6）洗耳球1个；

（7）搪瓷盘1个；

（8）微量加样滴头；

（9）吸水纸。

3．本试剂盒内含5种试剂：

（1）脲酶（冻干）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　2瓶

（2）pH　8．0缓冲液：由乙二胺四乙酸二钠盐和磷酸氢二钾组成　　　1×46ml

（3）显色剂Ⅰ：由苯酚和亚硝基铁氰化钠组成　　　　　　　　　　　1×225ml

（4）显色剂Ⅱ：由氢氧化钠和安替福民组成　　　　　　　　　　　　1×225ml

（5）尿素氮标准液（20mg／dl）　　　　　　　　　　　　　　　　　　2×2ml

四、实验步骤

1．血清

（1）取脲酶一瓶，用23．0ml pH　8．0缓冲液溶解。

（2）于一系列试管中，按下表加入各溶液。

表12－1　系列反应管中所加溶液的量

（3）于37℃水浴中保温15min，然后各管分别加入显色剂Ⅰ和显色剂Ⅱ各2．5ml。

（4）再于37℃水浴中保温20min，取出冷却至室温，于721分光光度计／AT－648半自动生化分析仪上550nm波长下比色。以空白管校正“0”点、读取各管的光密度。

2．尿液　用无氨水将尿液稀释20倍，再按上法测定。

五、实验结果与分析

线性范围：血清中尿素氮含量为100mg／dl或尿液中尿素氮含量为2　000mg／dl以内，用本试剂盒测得的结果线性良好。

六、实验报告

参照《营养学》、《生物化学》原理分析。

七、注意事项

1．试剂为空白对照；

2．每组样品做2～3个平行实验；

3．正常参考值：正常人血清尿素氮含量为5～17mg／dl；尿素氮标准液20mg／dl＝7．14mmol／L。