一乙酰一肟法测定血清尿素的原理

尿素(BU)是人体蛋白质代谢的终产物。血尿素浓度受多种因素的影响,如机体蛋白质的分解代谢、蛋白质的摄入量、肾的排泄功能等。尿素分子量小,可自由通过肾小球滤膜进入原尿,约50%可被肾小管重吸收。在饮食及体内分解代谢比较稳定的情况下,血尿素浓度取决于肾的排泄能力。因此,血尿素浓度在一定程度上反映肾小球的滤过功能。血尿素检验方法简便,是临床常用的肾功能指标。

尿素测定方法有两大类:一类是直接法,尿素直接与试剂作用,利用显色反应测定其含量,最常见的是二乙酰一肟法;另一类是尿素酶法,脲酶催化尿素分解产生氨,用不同的方法测定氨的量再换算成尿素,如酶偶联速率法、脲酶比色法、电导法、纳氏试剂显色法等。

(一)二乙酰一肟法

【原理】 在酸性条件下加热,二乙酰与尿素缩合成粉红色的二嗪化合物(4,5-二甲基-2-氧咪唑),其颜色的深浅与尿素含量成正比。由于二乙酰不稳定,在反应系统中二乙酰一肟与强酸作用,产生二乙酰,后者立即与尿素反应,缩合成红色的二嗪化合物。反应式如下:

【器材与试剂】

1.器材 试管、试管架、刻度吸管、沸水浴箱、分光光度计。

2.试剂

(1)酸性试剂:在三角烧瓶中加入蒸馏水约100ml,然后慢慢加入浓硫酸44ml及85%浓磷酸66ml,冷却至室温后,加入氨基硫脲50mg,硫酸镉(3CdSO 4·8 H 2 O)2g,溶解后用蒸馏水定容至1L。置棕色瓶中放冰箱保存,可稳定半年。

(2)二乙酰一肟溶液:称取二乙酰一肟20g,用蒸馏水溶解并定容至1L。置棕色瓶中放冰箱保存,可稳定半年。

(3)尿素标准储存液(100mmol/L):称取干燥纯尿素(相对分子量60.06)0.6g,溶解于蒸馏水并定容至100ml,加0.1g叠氮钠防腐,放冰箱保存,可稳定半年。

(4)尿素标准应用液(5.0mmol/L):取5ml尿素标准储存液用蒸馏水稀释至100ml。

【操作】 取3支试管,按表10-1操作。

表10-1　二乙酰一肟法测定血清尿素的操作步骤

混匀,置沸水浴中煮沸12min,取出置冷水中冷却5min后,在540nm波长处以空白管调零,读取各管吸光度。

【计算】

【参考区间】 血清尿素:1.78~7.14mmol/L。

【质量保证】

1.试剂中加入氨基脲和镉离子,可增进显色强度和色泽稳定性,但仍有轻度褪色现象(每小时<5%)。加热显色经冷却后应及时比色。

2.此法显色后有褪色现象,煮沸时间延长吸光度下降,注意沸水面应高于试管内液面。

3.尿液先用蒸馏水作1∶(50~200)稀释后测定,其结果乘以稀释倍数。

4.以前习惯用mg/dl和mmol/L尿素氮表示尿素浓度,因1mmol尿素相当于28mg尿素氮,所以1mmol/L尿素相当于2.8mg/dl尿素氮;1mmol/L尿素=2mmol/L尿素氮。WHO推荐尿素用mmol/L表示,我国卫生部临检中心规定一律使用此表示方法,不再用尿素氮一词。

【应用评价】

1.线性范围 可达7.14mmol/L。

2.回收率 96%~102.1%。

3.特异性 血清中含氮化合物对本法有干扰,如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素,在反应中也产生带色的产物,但这些化合物在血清中浓度很低,故干扰不明显。

4.方法优缺点 本法试剂单一,方法简便,但试剂有毒性和腐蚀性。

5.反应温度 在样本数量多时,加热开始时很难达到100℃,各管的受热温度可能不一致,本法重复性不佳。实验时可酌情改善加热条件。

【临床意义】 尿素是体内蛋白质分解代谢的终产物之一,由肾排泄,血清尿素的含量可以反映肾的排泄功能。

1.血清尿素浓度增高 见于生理性和病理性增高。

(1)生理性增高:高蛋白饮食可引起血清尿素浓度增高。男性比女性平均高0.3~ 0.5mmol/L,随年龄的增长有增高的倾向。成年人日间生理变动平均为0.63mmol/L。孕妇由于血容量增加,尿素浓度比非孕妇低。

(2)病理性增高:见于肾前性、肾性和肾后性3个方面。①肾前性因素:主要是失水,引起血液浓缩,肾血流量减少,肾小球滤过率减低,使血液中尿素潴留。常见于剧烈呕吐、幽门梗阻、肠梗阻和长期腹泻等。②肾性因素:如急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等。③肾后性因素:前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤等,使尿道受压,尿路阻塞引起血尿素含量增加。

2.血清尿素浓度降低 较少见,常见于严重肝病。

(二)酶偶联速率法

【原理】 尿素经脲酶水解生成2分子NH 3和1分子CO2,NH 3在α-酮戊二酸和NADH存在下,经谷氨酸脱氢酶(GLDH)催化生成谷氨酸和NAD+。NADH在340nm波长处有吸收峰,其吸光度下降的速率与待测样本中尿素的含量成正比。反应式如下

【器材与试剂】

1.器材 分光光度计、自动生化分析仪。

2.试剂

(1)酶试剂:p H 8.0 Tris-琥珀酸缓冲液150mmol/L、脲酶8000U/L、谷氨酸脱氢酶(GLDH)700U/L、NADH 0.3mmol/L、α-酮戊二酸15mmol/L、ADP 1.5mmol/L。

(2)尿素标准应用液(5.0mmol/L):参见二乙酰一肟法。

【操作】

1.基本参数

方法:速率法 样本/试剂:1/100

反应温度:37℃ 波长:340nm

延滞时间:30s 读数时间:30s

2.操作 按表10-2操作。

表10-2　酶偶联速率法测定血清尿素的操作步骤

混匀后,立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(ΔA/min)。本法适用于各类自动生化分析仪,测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。

【计算】

【参考区间】 参见二乙酰一肟法。

【质量保证】

1.空白管吸光度应>1.00,当试剂浑浊或吸光度<1.00时不应再用。

2.所用器材和去离子水应避免NH 4+污染,否则结果偏高。

3.血液样本最好用血清,含NaF的血浆可导致结果偏低。

4.在内源性氨正常时,能用本法测定尿液中的尿素。因在反应的最初几秒内,内源性氨很快被耗尽,在延滞期后测定的吸光度,是由脲酶催化尿素反应生成的氨所致。

【应用评价】

1.线性上限:17.85mmol/L。

2.回收率:93.0%~105.3%。

3.变异系数:批内CV 0.78%,批间CV 2.94%。

4.血红蛋白对测定有一定干扰,应避免样本溶血。在自动分析仪中测定,因样本被大量稀释,故不受其他含氮化合物、胆红素、血红蛋白及高血脂的干扰。