血清磷测定（钼蓝比色法）

实验十九　血清磷测定（钼蓝比色法）

一、实验目的与要求

1．了解血清磷在人体营养学上的意义及其在生理学上的重要性。

2．掌握血清磷测定的原理和方法。

二、实验原理

血清中无机磷即指以无机磷酸盐形式存在的磷。磷酸与钼酸形成磷钼酸，磷钼酸被还原剂（本法用Fe^2＋）还原生成钼蓝，钼蓝为低价钼的化合物，溶液呈蓝色。此蓝色深浅与无机磷量成正比。血清除蛋白滤液与磷标准液同样处理呈色，进行比色定量。

三、实验仪器与试剂

1．仪器

（1）722分光光度计；

（2）2　000rpm离心机；

（3）5ml移液管；

（4）微量加样器；

（5）20ml试管。

2．试剂

（1）12%三氯醋酸液：CCl₃COOH　12g加水100ml溶成。血清除蛋白用。

（2）11．5%三氯醋酸液：空白及标准稀释液用。

（3）磷标准液

①贮存液：纯KH₂PO₄0．585　3g加水溶成1L。放冰箱中保存。此液3ml中含磷0．4mg。

②应用液：取上液20ml，用11．5%三氯醋酸液准确稀释成100ml。此液3ml中含磷8μg。

（4）硫酸亚铁钼酸铵液

①10%钼酸铵5mol／L硫酸液：先配制5mol／L硫酸液，向约600ml水中慢慢加入浓硫酸278ml边加边摇匀，冷后加水成1L，混匀。

称取（NH₄）6Mo₇O₂₄·4H₂O　50g，放大烧杯中，边摇边加5mol／L H₂SO₄液约400ml，全溶后移入500ml量杯中，并用5mol／L H₂SO₄液冲洗烧杯，使全部移入容量瓶中，加5mol／L H₂SO₄液到刻线，混匀。

②硫酸亚铁钼酸铵液要在临用前新配。移取上液10．0ml放入100ml干净的容量瓶中，加水约70ml，混匀。加入FeSO₄·5H₂O粉末5g，加水到刻线，振摇使结晶全溶并混匀，必要时过滤。放棕色瓶中。

四、实验步骤

1．于试管或离心管中加12%三氯醋酸液3．8ml，加血清0．2ml，充分混匀，过滤或离心（1　500～2　000rpm，10min）。

2．取3只试管，做好记号，分别加入如下液体：

B（空白）　11．5%三氯酸液3ml

S（标准）　标准液（含磷8μg／ml）3．0ml

U（检品）　血清除蛋白上清3．0ml

3．各加硫酸亚铁钼酸铵溶液2ml，混匀，约10min后进行比色。用650nm或红色滤光板以空白管调零，读取标准管及检品管光密度值（Ds、Du）。

五、实验结果与分析

血清无机磷mg／dl＝Du／Ds×0．008×100／（0．2×3／4）＝Du／Ds×16／3

七、实验报告

参照《营养学》、《生物化学》原理分析。

八、注意事项

1．试剂为空白对照；

2．每组样品做2～3个平行；

3．正常参考范围：成人为3～5mg／dl（0．97～1．61mmol／L），儿童为（1．29～1．94mmol／L）。