核酸杂交原理及其发展历史

第一节　核酸杂交原理及其发展历史

一、核酸结构与性质

核酸是遗传的物质基础，可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。所有真核生物细胞都含有这两类核酸。核酸的基本结构单位是核苷酸。核苷酸由一个含氮碱基（嘌呤或嘧啶）、一个戊糖（核糖或脱氧核糖）和一个或几个磷酸组成。RNA含β^－D－核糖，DNA含β^－D－2－脱氧核糖，核糖和碱基缩合而成核苷。组成RNA的主要核苷有：腺嘌呤核苷（A）、鸟嘌呤核苷（G）、胞嘧啶核苷（C）和尿嘧啶核苷（U）。组成DNA的主要核苷有：腺嘌呤脱氧核苷（dA）、鸟嘌呤脱氧核苷（dG）、胞嘧啶脱氧核苷（dC）和胸腺嘧啶脱氧核苷（dT）。核酸还含有少量稀有碱基。核苷中核糖的羟基磷酸酯化，就形成核苷酸。核苷酸再通过3′，5′－磷酸二酯键连接构成了核酸一级结构（图4－1）。

DNA二级结构的空间结构模型是在1953年由Watson和Crick两个人提出的。建立DNA空间结构模型的依据主要有两方面：①由Chargaff发现的DNA中碱基的等价性，提示═A T、G≡C间碱基互补的可能性；②DNA纤维的X线衍射分析资料，提示了双螺旋结构的可能性。DNA是由两条反向直线型多核苷酸组成的双螺旋分子。单链多核苷酸中两个核苷酸之间的唯一连接键是3′，5′－磷酸二酯键。按Watson－Crick模型，DNA的结构特点：①两条反相平行的多核苷酸链围绕同一中心轴互绕；②碱基位于结构的内侧，而亲水的糖磷酸主链位于螺旋的外侧，通过磷酸二酯键相连，形成核酸的骨架；③碱基平面与轴垂直，糖环平面则与轴平行；④两条链皆为右手螺旋；⑤双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核酸之间的夹角是36°，每对螺旋由10对碱基组成；⑥碱基按═A T，G≡C配对互补，彼此以氢键相维系。维持DNA结构稳定的力量主要是氢键和碱基堆积力（图4－2）。

图4－1　DNA的一级结构

图4－2　DNA的二级结构

具有二级结构的DNA还可以进行形成更高级结构，如超螺旋结构（三级结构），以及与蛋白质结合形成核小体（四级结构）。

RNA为单链分子，但不同类型的RNA分子可自身回折形成发卡、局部双螺旋区，形成二级结构，并折叠产生三级结构，RNA与蛋白质复合物则是四级结构。例如tRNA的二级结构为三叶草形，三级结构为倒L形。

核酸的糖苷键和磷酸二酯键可被酸、碱和酶水解，产生碱基、核苷、核苷酸和寡核苷酸。酸水解时，糖苷键比磷酸酯键易于水解；嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键易于水解；嘌呤碱与脱氧核糖的糖苷键最不稳定。RNA易被稀碱水解，产生2′和3′－核苷酸，DNA对碱比较稳定。细胞内有各种核酸酶可以分解核酸。

RNA和DNA都是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯酚等有机溶剂。核酸的碱基和磷酸基均能解离，因此核酸具有酸碱性。核酸中的磷酸残基在pH高于4时全部解离，呈阴离子状态，因此在电泳中向阳极移动。核酸的碱基具有共轭双键，可强烈吸收200～300nm波段的光，最大的吸收峰为260nm，利用这一特性，可以对核酸进行定量测定。

二、核酸的变性与复性

在一定的理化条件下，DNA双链间的氢键断裂，最后双链分开成为无规则线团，这一过程称为DNA的变性。变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，但共价键并未断裂。引起变性的因素很多，升高温度、过酸、过碱以及加入变性剂（如甲酰胺、甲醛和尿素）等都能造成核酸变性。核酸变性时，物理、化学性质将发生改变，如黏度降低、密度增高和光吸收增强。在260nm处的吸收值增高，称为增色效应。增色效应达到最大值的50%的温度称为熔解温度（melting temperature，Tm），（图4－3）。Tm受到DNA双链的长度（L）、碱基组成（G＋C）和不配对碱基的百分数（%m）的影响，也受到溶液的pH值、离子强度（M）和变性剂如甲酰胺（F）的影响。

Tm＝81.5＋0.41×（%G＋C）－650/L－%m＋16.6×lgM－0.72×（%F）

图4－3　DNA的解链曲线（A）及Tm与（G＋C）含量的关系（B）

热变性的DNA如缓缓冷却，已分开的互补链又能重新缔结成双链，称为DNA的复性或退火。复性的速度受DNA的浓度、片段的大小、温度和离子强度的影响。由DNA复性研究发展成的一种实验技术，就是核酸分子杂交。

核酸分子杂交是指两条来源不同的核酸单链在一定条件下根据碱基配对的原则缔结成局部或全部双链。杂交可发生在DNA与DNA、RNA与RNA或DNA与RNA之间。DNA－DNA杂交可用于分析基因的结构（基因缺失和突变等），估测DNA间的同源序列和不同生物在进化过程中的相关性，分析基因拷贝数，以及进行DNA限制酶切片段图谱的作图等。DNA－RNA杂交可确定基因与它的转录物RNA之间的关系，分析基因的表达情况。杂交过程是高度特异的，形成的杂交体（hybrid）的双方是待测核酸及探针。探针以放射性核素或非放射性物质标记，以利于杂交信号的检测。

三、核酸杂交技术发展历史

核酸杂交技术基本上是Hall等在1961年开始的，他们将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它启动了核酸杂交技术的研究。Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA－琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其他互补核酸序列杂交。该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。20世纪60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法，首先从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，经煮沸使双链DNA（dsDNA）热变性成单链DNA（ssDNA）。然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV 260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。通常该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。

20世纪60年代中期Nygaard等的研究为应用放射性核素标记的DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。进入70年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如，mRNA纯化技术的发展首次使珠蛋白mRNA被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。

20世纪70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。1975年，Southern发明了Southern印迹杂交，随后出现了Northern印迹杂交。以后，各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA探针。

由于核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。DNA芯片的发展，使杂交技术进入规模化和信息化。随着核酸－核酸、蛋白质－核酸相互作用研究的深入，核酸杂交技术的应用越来越广，新的核酸分子杂交类型和方法也不断涌现。