固相核酸分子杂交类型

(一)Southern印迹

Southern印迹杂交技术是一种膜上检测DNA的杂交技术。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。Southern印迹杂交技术主要包括两个过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

Southern印迹杂交基本方法是首先将DNA标本用限制性内切酶消化后经琼脂糖凝胶电泳分离，然后经一定的方法将DNA片段转移到固体支持物后即可用于杂交。用32P标记的探针与附着在滤膜上的DNA杂交，利用放射自显影确定探针互补的DNA带的位置，从而可以确定特定序列的DNA片段的位置和大小(图5-9)。

图5-9　Southern印迹杂交

(二)Northern印迹

Northern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是操作程序略有差异。

(1)RNA极易被环境中存在的RNA酶所降解，所以在提取过程中需特别注意RNA酶的污染。

(2)RNA变性的方法与DNA不同，不能用碱变性，因为碱会水解RNA的2′-羟基基团，在甲醛或聚乙二醛、甲基氢氧化汞等变性剂的存在下使RNA变性，变性剂的作用是防止RNA分子形成发夹式的二级结构，保持其单链状态。

(3)印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗，然后再印迹、杂交。

(4)如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。

(三)斑点杂交(dot blot)

斑点杂交(dot-blot)是将待检样品(DNA、RNA或细胞)直接点到膜上，烘烤固定。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，它们在一张膜上可同时检测多个样品，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时膜就可以进行杂交(图5-10)。

这种杂交方法不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。但缺点是结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列，多用作核酸定性或半定量分析。

(四)菌落杂交(colony hybridization)

菌落杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。用于重组细菌克隆的筛选(图5-11)。

(五)原位杂交

图5-10　斑点杂交

图5-11　菌落杂交

原位杂交(in situ hybridization)是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此，原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究之中。其应用有以下几方面：①正常或异常染色体的基因定位；②应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达；③应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等。由于原位杂交不需要从组织、细胞中提取核酸，并可完整地保持组织与细胞的形态；此外，近年来随着核酸原位杂交的方法和探针标记技术的不断改进和完善以及商品试剂盒的涌现，使原位杂交技术在分子诊断学、遗传学、细胞生物学、发育生物学等领域得到了广泛的应用。

(六)荧光原位杂交

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它将荧光信号的直观性、高灵敏度、安全性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交(图5-12)，在荧光显微镜下对荧光信号进行分析和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的诊断和分型提供准确的依据。至今，FISH技术在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用，显示出与一些传统技术相比的明显优势。

图5-12　荧光原位杂交

由于FISH技术的探针是将荧光染料与抗体蛋白相结合进行检测，因而它们具有高度亲和力，具有放射性探针相同或更高的分辨率。现可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。1992年运用这种策略已能在中期染色体和间期细胞中同时检测7个探针。科学家们的目标是实现24种不同颜色来观察22条常染色体和X、Y染色体(图5-13)。这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。

图5-13　荧光原位杂交检测人类染色体

总之，核酸杂交技术是现代生物学重要技术之一，相信随着分子生物学及相关科学的进一步发展，核酸杂交技术一定会有更广阔的应用前景。