多克隆抗体与单克隆抗体虽然广泛的应用于医学领域，但均来源于异种动物，具有较强的免疫原性，在人体内的应用尤其在治疗方面受到很大的局限。在20世纪80年代诞生了应用DNA重组和蛋白工程技术制备的基因工程抗体。基因工程抗体较其他两种抗体具有以下优点：①能降低甚至消除人体对抗体的免疫排斥反应；②相对分子质量较小，易穿透血管壁，可进入病变的核心部位利于治疗；③可以利用原核细胞、真核细胞和植物等表达，且表达抗体量大，从而大大降低生产成本。
一、基因工程抗体的概念
应用DNA重组和蛋白质工程技术，对抗体编码基因按需要的不同进行切割、拼接、修饰和重组，然后将改造基因导入适宜的受体细胞，使其表达的一种新型抗体，称基因工程抗体（genetic engineering antibody，GEAb）。这种新抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构，但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，还可赋予抗体分子新的生物学活性。
二、基因工程抗体的种类
目前制备的基因工程抗体主要有人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白、双特异性抗体等。
1.人源化抗体 人源化抗体有嵌合抗体和改型抗体两种。嵌合抗体是最早制备成功的基因工程抗体，从杂交瘤细胞分离抗体可变区基因与人Ig恒定区的基因连接，插入适宜的质粒载体，然后转染骨髓瘤细胞，表达鼠－人嵌合抗体。这种抗体保留鼠源性单克隆抗体的特异性和亲和力，但大大减少其免疫原性，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，有利于临床应用。
虽然嵌合抗体的异源性已明显低于鼠单克隆抗体，但其可变区仍保留鼠源性，为了进一步降低抗体的免疫原性，近年来在嵌合抗体的基础上构建了改型抗体。其制备是将人抗体可变区中互补决定区（CDR）序列改换成鼠源性单克隆抗体CDR序列。人源化抗体的产生和发展，使得多种鼠源性单抗可应用于临床治疗。
2.小分子抗体 小分子抗体是指相对分子质量小，具有抗原结合功能的分子片段，包括抗原结合片段（Fab）、可变区片段（Fv）、单链抗体（ScFv）等。此种抗体分子小，可在大肠杆菌等原核细胞中表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。Fab片段是由H链Fd段和完整L链通过二硫键连接形成的异二聚体，仅有一个抗原结合位点。Fv是由H链和L链V区组成的单价小分子，是结合抗原的最小功能片段。ScFv将Ig的H链和L链的V区连接，形成单一的多肽链。多肽链能自发折叠形成天然构象，从而可保持Fv的特异性和亲和力。
3.抗体融合蛋白 抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体分子片段与其他生物活性蛋白融合而获得的融合蛋白。抗体融合蛋白因融合的蛋白质的不同而具有多种生物功能，如将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过抗体的引导，可将这些生物活性物质导向靶部位；ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，使得细胞具有结合某种抗原的能力。
4.双特异性抗体 双特异性抗体又称双功能抗体，该抗体的两个抗原结合位点具有不同的特异性，结合两种不同的抗原分子。如由抗肿瘤抗原的抗体和抗细胞毒性效应细胞（CTL、NK细胞、LAK细胞）表面分子的抗体（CD3抗体或CD16抗体）制成的双特异性抗体，既能结合肿瘤细胞，又能结合细胞毒性效应细胞，促使细胞毒性效应细胞发挥抗肿瘤作用。
5.噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是近年发展起来的一项新的基因工程抗体技术。它是将体外克隆的抗体或抗体片段基因插入噬菌体的基因组DNA中，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异性的单克隆抗体。利用该技术可以获得完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤诊断与治疗方面有其特殊的价值。
（吴正吉、甘晓玲）
重点提示
1.抗原的制备 可溶性抗原的制备均需先处理细胞使其释放出来。破碎细胞的方法有细胞匀浆、超声波破碎法、酶处理法等，然后用超速离心法、选择性沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等进行纯化而获得。最后进行抗原含量、相对分子质量、纯度和免疫活性鉴定。
2.半抗原的制备 由于半抗原只有结合载体才具有免疫原性，因此其制备的关键是载体，常用作载体的物质有蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物等。
3.免疫佐剂的理解 免疫佐剂进入机体不是其本身刺激机体发生免疫反应，而是增强机体对抗原的应答反应。如疫苗接种应用佐剂可使机体特异性抗体分泌量增加，所以疫苗接种或制备抗血清时常需加入佐剂。人类和动物使用不同类别的佐剂。免疫佐剂可以无免疫原性，也可有免疫原性，有时可引起免疫损伤（肉芽肿等）。
4.抗血清、单克隆抗体、基因工程抗体的理解 针对抗原而言，抗血清是单一的特异性抗体，由一种抗原刺激免疫动物产生；针对抗原表位而言，抗血清是混合抗体，由多个B细胞克隆产生。单克隆抗体是针对一种抗原表位的高度均一的纯抗体，通过一个B细胞和一个骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生。基因工程抗体是通过改变抗体蛋白的遗传物质而产生的一种新抗体，与原有的抗体相比，它保留了一些原有抗体的活性，但也赋予一些新的活性。这三种抗体因其特点不同，其制备方法、临床应用也有所差异。
5.抗血清的制备 抗血清是用含有特异性抗体的动物血清制品，人为地将某种抗原接种动物以刺激动物发生免疫应答反应，从而产生的特异性抗体。抗血清的制备包括：①抗原的制备；②免疫动物（动物选择、免疫方案制订与实施）；③收获抗血清（采血、分离纯化血清）；④抗血清的鉴定（抗体特异性、效价、纯度和亲和力鉴定）；⑤抗血清的保存（根据需要可选择4℃保存、冷冻保存或真空干燥保存）。
6.单克隆抗体的制备过程
因此，单克隆抗体制备包含两个主要步骤：①融合、筛选、克隆杂交瘤细胞；②单克隆抗体制备。
7.杂交瘤细胞的制备 单克隆抗体制备的前提是要获得B细胞杂交瘤细胞株。细胞融合、HAT培养基选择培养是杂交瘤细胞技术的关键。取免疫小鼠的脾细胞和具有体外增殖能力的小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合，通过HAT选择培养能生长的细胞即为杂交瘤细胞，经过反复的免疫学检测筛选和扩大培养，获得能产生目的单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
目标检测
一、单项选择题
1.细菌的菌体免疫原常规的制备方法是（ ）。
A.75%乙醇处理 B.100℃加温2h处理 C.0.5%甲醛处理
D.1%氯化钙处理 E.2%氯肪处理
2.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法是（ ）。
A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法
D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法
3.最常用于偶联半抗原的载体是（ ）。
A.免疫球蛋白 B.人甲状腺球蛋白 C.人血清白蛋白
D.牛血清白蛋白 E.葡萄球菌A蛋白
4.蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫？（ ）
A.7～10天 B.10～20天 C.20～30天 D.30～60天 E.3个月
5.用可溶性抗原制得的抗体，鉴定特异性时，最好采用下列哪种方法？（ ）
A.间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法
D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法
6.纯化单克隆抗体时，除去杂抗体效果较好的方法是（ ）。
A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法
D.免疫亲和层析法 E.超速离心法
7.根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为（ ）。
A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法
D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法
8.要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到（ ）。
A.10个以上 B.15个以上 C.20个以上
D.50个以上 E.100个以上
9.较长时间（4～5年）保存抗体，通常采用的保存方法是（ ）。
A.4℃保存 B.－10℃保存 C.－20℃保存
D.－30℃保存 E.真空干燥保存
10.在HAT选择培养基中可长期存活的是（ ）。
A.细胞多聚体 B.融合的脾细胞与瘤细胞
C.融合的瘤细胞与瘤细胞 D.未融合的瘤细胞
E.未融合的脾细胞
二、简答题
1.简述基因工程抗体的概念和种类。
2.简述单克隆抗体的制备流程及临床应用。
3.免疫血清如何才能得到？应如何进行纯化和质量鉴定？
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