基因治疗的常用方法

（一）肿瘤基因治疗的技术途径

基因转移技术是基因治疗的关键技术之一，较常用的方法可分为物理方法和病毒方法两大类（表6-4），目前在临床应用上以反转录病毒载体介导的基因转移技术常用。

表6-4　基因转移技术分类

（续　表）

1．物理方法　最常用的有磷酸钙共沉淀法（calcium phosphate coprecipitation）、电击孔法（electroporation）、显微注射法（microinjection）、脂质体法（lipofectin）等。这些方法介导的基因转移一般转化细胞的效率较低，通常仅1／102～107，所转移的基因在靶细胞基因组的整合是随机的，且多数方法无法直接用于体内治疗。近年来还发展了几种新型的DNA转移方法，如微粒轰击法（particle bombardment）和配体-DNA复合物（ligand-DNA complex）基因转移等。微粒轰击法是将目的基因涂布于微细金颗粒表面，使用高压放电方法轰击靶组织，可在体内获较长期的目的基因表达。该法简便、快速，结合外科手术时可用于人体许多部位的直接基因转移。配体-DNA复合物基因转移则是将目的基因与特异性的多肽配体联接，通过受体介导的细胞内吞作用，使靶DNA在特定细胞类型中获得表达。由于内吞作用常导致靶DNA降解，故有人将上述复合物再联接腺病毒或流感病毒血凝素，破坏吞噬溶酶体，使靶DNA不被降解，获得了靶基因的高效定向表达。

2．病毒方法　包括反转录病毒法（retrovirus）、腺病毒法（adenovirus）、腺相关病毒法（adeno-associated virus，AAV）、疱疹病毒法（herpus virus）、痘苗病毒法、脊髓灰质炎病毒法等多种。病毒方法可将基因有效地转移至宿主细胞，其中反转录病毒和腺相关病毒可使外源DNA稳定地整合靶细胞基因组，从而获得稳定的长期表达，而其他病毒方法DNA并不整合至靶细胞基因组，一般在染色体外，故以瞬时表达为主。

（1）反转录病毒基因转移法：反转录病毒的分子结构可分为顺式作用序列和反式作用序列两部分。反式作用序列包含gag、pol和env三个结构基因，分别编码病毒外壳蛋白、反转录酶和整合酶及包膜蛋白。顺式作用序列包括病毒基因组两端的长末端重复序列（LTR）和Ψ位点，LTR中含有病毒基因转录和复制所必需的启动子和增强子序列；包装位点Ψ指导病毒颗粒的包装，产生有感染性的病毒颗粒，此外，在病毒3’端LTR中尚含有PolyA的加工信号等。反转录病毒的生活周期主要包括下列步骤：①病毒感染靶细胞；②病毒脱包膜；③病毒RNA反转录；④病毒基因DNA复制成双链；⑤双链病毒基因整合靶细胞基因组；⑥病毒基因转录产生RNA；⑦翻译产生病毒蛋白；⑧包装成完整病毒颗粒；⑨病毒出芽，下一个生活周期开始。反转录病毒载体的构建就是去除病毒的结构基因gag、pol、env，用外源基因包括选择标志基因如NeoR基因和目的基因如TNF基因等代替，但保留Ψ位点；这样产生的病毒是一种复制缺陷病毒，需外界提供包装蛋白如env产物等方能产生完整的有感染力的病毒颗粒，故目前常使用包装细胞来完成病毒的体外扩增。包装细胞系的构建是用去除Ψ位点的反转录病毒感染NIH3T3细胞，由此得到的转染细胞可产生各种病毒基因和各种包装蛋白，但因无Ψ位点而不能包装产生完整的病毒颗粒。反转录病毒载体不含病毒基因但含有Ψ位点，故用其感染包装细胞时，其Ψ位点即可利用包装细胞内的各种包装蛋白而产生含载体的病毒颗粒。但这种包装细胞在实际应用时可能由于基因重组等原因而产生野生型反转录病毒而导致感染，故有人仅有gag和env质粒共转染3T3细胞而构建了新的包装细胞系，此种包装细胞因无pol基因而不产生完整病毒基因组，而只产生包装蛋白，这样就基本上排除了产生反转录病毒感染的危险性。由于反转录病毒结构简单，遗传修饰较容易，其生活周期已完全澄清，故目前临床应用的基因治疗方法大多使用反转录病毒载体，在实际使用中发现其具有许多优点，如100%的细胞可被感染并能表达重组外源基因；外源基因在靶细胞基因组的整合为单拷贝、单位点的；宿主细胞选择范围广泛，等等。但也发现一些不足之处，如主要感染分裂期细胞；由于随机整合故可能产生插入突变和重要基因灭活等；携带外源DNA量有限，仅约10kb；包装细胞系的使用尚不够稳定，易丧失env而无法包装产生病毒颗粒；在体内应用时转染效率常明显降低等。

（2）腺病毒载体及其他病毒载体：因基因组缺少E1区而成为复制缺陷型的腺病毒可在表达E1基因的工程细胞中生长传代，目前使用的大部分腺病毒基因载体多为去除部分E1A-E1B和E3的病毒基因组并整合外源基因而成，并利用E1A启动子，主要晚期启动子（MLP）和相关前导序列，E3启动子或外源启动子序列等来增强插入序列的表达。腺病毒载体的特点是对上皮细胞有亲和性，尤其是支气管上皮细胞，也可用于肝细胞、淋巴造血细胞和神经细胞等；在体外可产生大量的基因产物，可感染非分裂期细胞并可插入较大的外源序列；体内直接使用时插入基因表达可维持较长时间等。由于腺病毒是人体常见的致病原，故目前认为，这可能是由于腺病毒载体与体内野生型腺病毒产生基因重组所致，这就产生了腺病毒载体使用的安全性问题；另外，由于腺病毒的基因组较大，故腺病毒载体的设计构建也较为复杂。

其他病毒基因载体主要有腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒及其他一些RNA病毒。AAV主要感染造血细胞和上皮细胞，其主要特点是可位点特异性地整合至人类19号染色体的某个较小的区域，且可整合至非分裂期细胞。这种特性将有助于减少基因插入突变或基因灭活的可能性。但AAV的许多生物学特性目前还未弄清楚，其转染细胞的效率较低，外源基因的容量也有限，仅约4kb，故其应用目前还有不少限制。疱疹病毒主要用于神经系统细胞的基因转移，具有基因转染效率高，外源基因容量大（可达30kb）等特点。但由于疱疹病毒的基因组较大（约150kb），其复制过程调节机制复杂，可产生大量各种病毒基因产物，故目前其使用的安全性尚未能够解决。痘类病毒载体及其携带的外源基因产生的基因产物具有较强的免疫原性，故在制备肿瘤疫苗方面具有较大的应用前景。

（二）肿瘤基因治疗的受体细胞

受体细胞或靶细胞是决定肿瘤基因治疗疗效的关键因素之一，故具有肿瘤基因治疗临床应用前景的受体细胞应满足一定的条件，如来源丰富、易于培养成活和体外扩增、可耐受各种选择因素、外源基因易于整合和稳定表达等。目前已进入肿瘤基因治疗临床或临床前研究的受体细胞可分成四类：淋巴细胞、肿瘤细胞、造血干细胞和其他细胞（如成纤维细胞、血管内皮细胞）等，其特性见表6-5，在实际应用中各有特点。其中最常用者当推淋巴细胞，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），因具有选择性瘤灶浸润特性，故一开始就备受青睐。当前的研究十分注重分离具有高度靶向性的TIL，或将其与适当的配体或抗体偶联，以便携带效应基因至肿瘤局部发挥效应。肿瘤细胞是类化学疗法的靶细胞，近年来有人使用基因转移技术将不同外源基因导入肿瘤细胞，可增强其免疫原性或激活细胞毒T细胞的能力，使之成为兼具治疗和预防复发作用的“瘤苗”（tumor vaccine）。骨髓干细胞的分离培养和体外扩增及鉴定目前还存在一定困难，外源基因也不易整合和稳定表达，但已有人在动物实验中用反转录病毒载体将MDR-1基因转移入骨髓干细胞，使之能够耐受大剂量紫杉醇化疗。其他细胞如成纤维细胞和皮肤细胞等作为外源基因受体也有其自身的优势，Culver等将用HS-TK基因修饰的成纤维细胞与肿瘤细胞混合后注射于瘤体内或皮下，发现前者表达的HS-TK基因可转移至肿瘤细胞并表达，使肿瘤细胞对GCV敏感；但Tsai等则发现，若使用肿瘤细胞作为局部淋巴因子分泌源，较之使用肿瘤间质成纤维细胞将更能诱导较强的抗肿瘤免疫反应，并认为这可能也与肿瘤排斥反应的“共刺激信号”机制有关。

表6-5　肿瘤基因治疗的受体细胞

（三）基因-病毒疗法

1．肿瘤特异性增殖病毒及基因-病毒疗法用病毒来溶解肿瘤细胞的概念已有上百年历史。近十年来，随着对病毒的结构、蛋白质功能了解的增加以及肿瘤生物学的发展，有数家实验室对病毒的基因组结构进行了改造。改造后的病毒对肿瘤细胞的感染性、复制能力和（或）溶细胞作用增加，而对正常细胞则上述能力下降，甚至完全消失，从而能特异性地在肿瘤细胞内复制及增殖，并特异性地杀灭肿瘤细胞，而对正常细胞的毒性作用非常低。这种病毒称为肿瘤特异性增殖病毒或溶瘤增殖病毒，我们简称为肿瘤增殖病毒。肿瘤增殖病毒进入肿瘤细胞后，可使病毒的量成千上万倍放大，病毒介导的感染细胞裂解，释放出的新病毒扩散并感染周围肿瘤细胞，这种病毒不断感染、增殖及溶解肿瘤细胞。从理论上讲这种自身持续性治疗一直要持续到肿瘤细胞完全杀灭和（或）产生宿主免疫反应终止病毒的复制。同时，病毒杀死肿瘤细胞是通过直接溶解、分泌毒性蛋白以及激发免疫疫苗反应等机制，它与传统化疗及放疗的作用机制完全不同，几乎无交叉耐受性。目前肿瘤的增殖病毒治疗研究已引起人们的广泛关注。近年已有10种不同病毒进入临床试验，其中研究最早也是研究最快的是ONYX制药生化公司的产品——腺病毒ONYX-015，该病毒的Ⅱ期临床试验取得了令人鼓舞的结果，它联合常规化疗治疗30例常规治疗无效的头颈部肿瘤，可使63%的肿瘤缩小一半以上，27%的肿瘤完全消退，这是目前最有效的肿瘤生物治疗的临床报告，该研究现已进入Ⅲ期临床试验。

但是，单用肿瘤增殖病毒治疗肿瘤也并非十分理想，如上述已提到腺病毒ONYX-015单独治疗只有15%～20%的临床有效率，它必须联合常规化疗才能达到令人满意的疗效。为此，第二军医大学东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室以吴孟超、钱其军为首的科研小组，提出并倡导将基因治疗与病毒治疗相结合的新策略，即应用肿瘤增殖病毒携带抗癌基因，利用该病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，其抗癌基因拷贝数成千上万倍增加，从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量。由于病毒在正常细胞内不增殖，从而使抗癌基因在肿瘤细胞内特异性且高效表达，它克服了传统肿瘤基因治疗的转染率低、靶向性差、抗瘤基因表达量低以及病毒治疗对肿瘤杀伤力不足的缺点。这种结合病毒治疗与基因治疗优点的新型治疗方案，称之为基因-病毒治疗法。这种新型的肿瘤治疗方案充分利用了病毒体积小、弥散力及复制力均较强的优点，在肿瘤原发灶及转移灶局部形成高浓度病毒，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的。同时由于病毒携带抗癌基因，该基因随着病毒在肿瘤细胞内复制，从而在肿瘤细胞内高效表达抗癌基因，两者协同作用将进一步提高抗肿瘤的疗效。

2．以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗　由于端粒酶在绝大多数恶性肿瘤中被激活，是目前所发现的恶性肿瘤最为广谱的分子标记，而其在正常体细胞中一般为阴性表达，因此端粒酶是进行肿瘤基因治疗的理想靶点。从理论上讲，针对端粒酶的肿瘤基因治疗比单纯针对某个癌基因或抑癌基因的治疗具有更为广阔的临床应用前景。目前国内外提出的以端粒酶为靶点的肿瘤治疗策略，主要是以抑制端粒酶活性的方法为主，包括针对端粒酶RNA组分（hTR）、端粒酶反转录酶（hTERT）及竞争性抑制反转录过程等方法。近来，国外又提出更优越的新策略，即以肿瘤组织端粒酶激活为靶点，以hTERT启动子调控其他抗肿瘤基因，从而达到靶向肿瘤细胞并破坏肿瘤细胞的目的。

（1）以抑制端粒酶活性为目标：研究证实，针对hTR模板区及其周围序列设计的反义核苷酸可抑制端粒酶合成端粒序列。早在1995年，Feng等构建了含hTR模板区反义序列的质粒并转染Hela细胞，经23～26次分裂后，细胞出现变圆、生长抑制、死亡等细胞危象，伴随端粒酶活性下降和端粒缩短。人工合成的反义寡核苷酸（ASONs）亦可封闭hTR的模板功能，但ASONs存在明显的弱点，即需要相对较长序列和较高浓度才能提高与hTR的亲和性和稳定性，而ASONs的加长又会影响细胞对它的摄取，并且ASONs在体内易被核酸酶降解。对此，Norton等设计了针对hTR模板区的反义肽核酸（peptide nucleic acid，PNA），它以多肽骨架替换DNA分子中磷酸脱氧核糖骨架，其重复单位为N-（2-氨乙基）-甘氨酸，具有与天然DNA分子相似的结构特征和结合特性，可与DNA或RNA形成稳定的Watson-Crick链。由于PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，分子内部残基间形成氢键，因此具有很高的化学稳定性，不易被核酸酶降解，而且仅需极短的序列（3～19bp）以及极低的浓度（IC50＝0．9nmol／L）即可发挥良好的反义抑制作用，是目前很有前途的端粒酶抑制分子。核酶是一类具有核酸内切酶活性的小分子RNA，可特异性地封闭靶基因RNA并切割RNA，使其失去生物功能。Yokoyama等设计了针对hTR不同序列区的锤头形核酶（TeloRZ），实验证实TeloRZ对人工合成的端粒酶RNA组分有专一的切割活性，在肿瘤细胞内靶向hTR模板区的TeloRZ能降低端粒酶活性。此外，对hTR模板区实行定点突变，或改变hTR空间构象，均可影响端粒酶的活性。Kim等构建多种hTR定点突变的基因表达质粒，转染人前列腺癌细胞株LNCaP和乳腺癌细胞株MCF-7，实验发现hTR突变模板的低水平表达即可以抑制肿瘤细胞的增生和肿瘤组织的生长，并引起细胞凋亡。

除了hTERT基因序列的反义核酸以及针对hTERT基因设计的锤头形核酶能够有效抑制端粒酶活性以外，Sogawa等还在一种海洋微藻类细胞中提取出微藻类多糖，它可以抑制K562细胞hTERT的表达，进而抑制端粒酶活性。Ducrest等发现人类第3号染色体上存在着直接或间接调控端粒酶活性的基因，将正常的3号染色体导入人乳腺癌细胞系21NT中，可以抑制端粒酶活性，引起细胞衰老。进一步研究证实，3号染色体对端粒酶活性的抑制是针对hTERT的。一些核苷酸类似物如7-脱氮-dGTP、7-脱氮-dATP、叠氮脱氧胸苷（AZT）等作为反转录酶抑制剂，能和正常单核苷酸竞争与模板区hTR结合，抑制端粒酶活性。二甲亚砜、维甲酸、TPA等细胞分化诱导剂，在诱导细胞分化过程中可使端粒酶活性下调，提示分化诱导剂可作为端粒酶抑制剂，来研究端粒酶活性调节及其在肿瘤治疗中的作用。其他靶向端粒酶活性的抑制剂，包括端粒酶抗体、与G-四联体结构相互作用的化合物、癌基因与抑癌基因、蛋白激酶C抑制剂、一些抗肿瘤药物等，对端粒酶活性也有下调作用，这些方面的文献已有较多报道，不再赘述。

（2）以端粒酶为靶点的增殖病毒疗法：将抗肿瘤基因特异地导入到肿瘤细胞内并有效控制基因的表达，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的，需要一个肿瘤特异性表达系统来保证整个治疗计划的安全性和有效性。现已有为数不少的组织或细胞特异启动子被鉴定并用于基因表达的调控，如靶向结、直肠癌的癌胚抗原（CEA）启动子、靶向乳腺癌的MUC1启动子、靶向肝癌的AFP启动子以及靶向鼻咽癌的EB病毒启动子等。用上述启动子调控外源基因的表达可获得相对特异的肿瘤靶向作用，但缺点也比较明显。首先，这些启动子只针对有限的组织起源的肿瘤细胞，不能广泛应用于大多数肿瘤的治疗；其次，与常用的病毒启动子相比，这些启动子作用相对较弱，所介导的基因表达量低。最近，人们将目光集中于端粒酶启动子的研究上来，采用hTERT基因启动子驱动抗肿瘤基因高效表达，靶向端粒酶阳性的肿瘤细胞，而对端粒酶阴性的正常细胞则不起作用。因此，hTERT启动子赋予了基因表达载体系统很高的肿瘤靶向特异性，由此进行的基因治疗是一项非常有前途的肿瘤治疗策略。

肿瘤的细胞凋亡被阻断，使其具有了无限增殖的能力，因此，重建肿瘤细胞的凋亡程序可能是肿瘤基因治疗的一项有意义的策略。Gu等通过体外实验证实，hTERT启动子核心序列控制LacZ基因，在肺癌、肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞系中均有高水平表达，在正常细胞中几乎未检测到阳性表达，两者比值超过500倍；对照组CMV启动子驱动的LacZ基因在肿瘤细胞和正常细胞中均有表达，两者比值仅2～10倍。动物实验结果发现，CMV启动子驱动LacZ基因在小鼠肝脾组织中有较高水平的表达，而hTERT启动子驱动LacZ基因在小鼠各内脏器官中未见表达。可见hTERT启动子介导抗肿瘤基因进行肿瘤的靶向治疗，不仅能保证目的基因的高效表达，而且靶向肿瘤细胞的特异性也很好。进一步将hTERT启动子驱动的Bax基因通过腺病毒载体转染肿瘤细胞，进行体内外实验，结果同样证实hTERT启动子能介导Bax基因在肿瘤细胞系中高效表达，并诱发肿瘤细胞出现明显的凋亡，小鼠模型显示肿瘤生长抑制、成瘤能力下降，通过检测小鼠血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶证实没有发生肝脏毒性反应。Caspase基因家族与哺乳动物细胞凋亡信号传导途径的激活有关。Koga等在端粒酶活性及hTERT mRNA均为阳性表达的前列腺癌、恶性胶质瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌共10种肿瘤细胞系中，以hTERT启动子驱动Caspase-8基因表达，诱导细胞发生高水平凋亡，其效果与对照SV40启动子所驱动的基因载体相差无几。在无端粒酶活性的两株正常纤维母细胞系中，SV40启动子驱动Caspase-8基因表达仍然诱导细胞发生较高水平的凋亡，其凋亡指数与肿瘤细胞系接近，但hTERT启动子控制的Caspase-8基因载体，在正常细胞系中则未检测到基因表达及细胞凋亡。在小鼠移植瘤中局部注射hTERT启动子控制的Caspase-8基因载体，肿瘤生长明显受到抑制，与注射前相比瘤体缩小至58%体积，肿瘤组织中大量细胞发生凋亡，而同期注射hTERT启动子控制的荧光蛋白酶（Luciferase）报道基因载体的肿瘤，体积增长至142%，而且未检测到细胞凋亡。实验证明了hTERT启动子介导的抗肿瘤基因治疗具有良好的肿瘤靶向特异性与安全高效性。

Majumdar等以携带HSV-tk基因并由hTERT启动子调控的表达质粒（hTERTp／tk）转染肿瘤细胞和正常细胞系，RT-PCR检测HSV-tk基因在端粒酶阳性的骨肉瘤细胞系143B、纤维肉瘤细胞系HT1080和永生化的293正常细胞系中高度表达，在端粒酶阴性的纤维母细胞系BJ、WI38和视网膜色素上皮细胞系RPE中阴性表达。所有端粒酶阳性的肿瘤细胞系和永生化细胞对GCV敏感，在GCV处理后5～7d细胞被破坏或杀灭，而GCV对端粒酶阴性的正常细胞没有影响。将转染了hTERTp／tk质粒的143B细胞注射到裸鼠体内，10d后给予GCV处理，可观察到肿瘤的生长完全受到抑制。如果将20%的转染细胞加到80%的未转染细胞中，种植于小鼠体内，亦可观察到明显的肿瘤生长抑制和对GCV处理的敏感性，显示出很强的“旁观者效应”。进一步将hTERTp／tk质粒的表达盒重组到腺病毒载体中，并以CMV启动子调控HSV-tk基因的腺病毒载体（CMVp／tk）为对照，实验表明两者均可感染143B细胞及其小鼠移植瘤细胞，使其对GCV处理产生细胞毒性反应，引起肿瘤生长抑制，小鼠荷瘤生存期延长，但与CMVp／tk相比，hTERTp／tk腺病毒载体对BJ正常细胞系几乎不产生影响，而且荷瘤小鼠也没有肝脏毒性作用。

在抗肿瘤新生血管形成的治疗过程中，人们发现了多种血管生成抑制剂，其中以抑制血管内皮细胞增殖的血管抑素和内皮抑素最受重视。采用血管抑素或内皮抑素基因反转录病毒载体介导两个基因的表达，可以在白血病和黑色素瘤动物模型的肿瘤中产生血管生成抑制和瘤细胞生长抑制的抗肿瘤效果。到目前为止，尚未见到有关采用hTERT启动子构建肿瘤特异性增殖病毒、调控血管抑素和内皮抑素基因进行抗肿瘤血管治疗的研究报道。第二军医大学东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室在这一方面已经进行了一系列研究，取得了初步的研究结果。首先，我们构建hTERT启动子核心序列驱动的血管抑素和内皮抑素基因表达质粒，再进一步重组产生肿瘤特异性增殖腺病毒载体。该病毒在端粒酶阳性的大多数肿瘤细胞中均有增殖复制，并介导目的基因高效表达，与传统腺病毒和其他病毒载体相比，其在各种肿瘤细胞中的表达量可高数百倍至上千万倍，在裸鼠肿瘤模型中足以产生较强的抗肿瘤血管生成的效果。更深入的研究计划正在进行中，预期在不久的将来即可取得较大进展。