切割前组织处理

显微切割的目的是为了进行后续实验，如果后续实验只是利用切割的组织或细胞的DNA进行相关研究，则组织处理过程较为简单，与常规处理相似，石蜡切片即可满足实验要求，但如果后续实验需要从被切割的组织或细胞中提取RNA或蛋白质，并进行相关分析，则通常采用冷冻组织切片或新制备的细胞片，从组织标本的收集开始就应加以注意。

（一）应用冷冻切片进行LCM

【标本收集】　无论是临床手术切除标本，还是动物实验收集的标本，离体后均需在液氮中迅速冷却片刻。如果不立即进行显微切割，标本应置于冻存管中－80℃冻存。也有研究者在冻存前使用固定剂进行前固定，这样可不同程度地保护组织RNA，其中30%蔗糖（PBS配制）对RNA保护作用较强。

【切片制备】　将待切组织块从－80℃冰箱取出，置于－30℃的冷冻切片机中，迅速以OCT包埋，连续切片，切片厚度4～10μm，一般选择8μm，因为切片过薄会减少捕获细胞数量；过厚会影响光镜下清晰分辨细胞形态，造成非目的细胞混杂。切取的冷冻切片平铺于预先高温烘烤过的载玻片上或LCM专用带EVA膜载片上（根据LCM仪器进行选择）。如果实验目的是利用提取的核酸及蛋白质进行相关实验，在操作过程中应尽量避免污染。切片前，切片机的载物台、机箱内部均应使用75%乙醇擦拭，晾干，必要时紫外照射30min，切片时尽可能使用新的刀片，如后期的研究涉及RNA，则所用器械均应用DEPC水浸泡去除RNA酶（如毛刷），载玻片、镊子等常规清洗干燥后，铝箔包裹，高温烤4h以上，同时，载玻片不应涂布任何黏附剂，否则，组织与载玻片紧密结合，影响捕获。一次切片不可过多，一般来说，所切的切片应在当天处理完毕，切片切好后，可暂时存放在－80℃冰箱冻存备用。

【切片处理】　切取的冷冻切片在室温下融化30～60s，当切片还未风干时立即浸入固定液中进行固定。常用的固定液有Methacarn、Uifix液、Bouin液、丙酮、70%乙醇、多聚甲醛及甲醛缓冲液，其中Methacarn固定时，RNA产量与DNA污染均处于比较满意的水平，需要注意的是固定液应使用DEPC水进行配制。

【染色步骤】　为了明确辨认目的组织或细胞，需要对组织进行必要的染色，如常规HE染色和免疫组化染色等。此外，还有一些染色方法，如甲基绿、核固红、瑞氏染料、亮绿红等。

1．常规HE染色　冷冻切片固定后经短暂漂洗即进行染色。目前，大部分研究者选用70%乙醇对冷冻切片进行固定，以抑制细胞内RNA酶的活性。由于显微切割的主要目的是获取组织或细胞的RNA进行后续分子生物学实验。因此，所有步骤均应注意加强对切割组织RNA的保护。为此，实验过程中所用染缸、金属玻璃器皿等在常规清洗干燥后，应用铝箔包裹，高温烤4h以上，所有液体均应用DEPC水进行配制。HE染色步骤亦不同于常规HE染色，需进行一定的改良。我国常采用改良方法如下。

（1）苏木精1s，冰水冲洗10s，伊红10s，85%、95%乙醇各10s，无水乙醇10s，2次，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4～10℃，总时间不超过6min。

（2）在铺过组织样本的切片上喷上过量的RNaseZAP，置室温孵育5min，以DEPC水漂洗5s，苏木素染色30s，DEPC水漂洗5s，0．1%伊红染色10s，DEPC水漂洗5s，70%乙醇脱水15s，95%乙醇脱水15s，无水乙醇脱水15s，二甲苯透明30s。

（3）切片浸入70%乙醇30s，苏木素染色1min，水洗1min，盐酸乙醇分化液分化2s，水洗1min，伊红染色10s，水洗1min，50%、70%、95%、100%的乙醇各脱水10s，二甲苯30s。上述改良方法的一个共同宗旨是缩短HE染色时间，缩短在水中的时间，从而减少RNA的降解。在HE染色后，室温干燥，尔后立即进行激光捕获。由于70%乙醇对冷冻切片进行固定后会出现捕获的细胞仍留在载玻片上而不能转移的现象，有研究者采用RNAlater（Qiagen公司）固定，亦取得不错的效果。

2．甲基绿染色　75%乙醇固定1min，0．5%甲基绿染色30s，双蒸水漂洗2次。室温下干燥后立即LCM。

3．甲苯胺蓝染色　蒸馏水漂洗5s，0．5%甲苯胺蓝染色5s，70%乙醇15s，95%乙醇15s，无水乙醇30s，无水乙醇30s，二甲苯1min。室温下干燥后立即LCM。

4．甲酚紫染色　贴有切片的膜浸入95%乙醇30～40s；75%乙醇30～40s；50%乙醇25～30S；甲酚紫（Cresyl　Violet）染色8～10s；50%乙醇25～30s；75%乙醇25～30s；95%乙醇30～40s；100%乙醇30～40s，2次；二甲苯淋洗3～4次；二甲苯5min。室温下干燥后立即LCM观察。

5．免疫组织化学染色　通过调整抗体浓度，优化染色条件，使整个染色时间限定在12～25min以内。

6．荧光免疫组化方法　由于大多数激光显微捕获系统未配备荧光显微装置，故采用较少。

总之，应结合自己使用的激光显微捕获系统、捕获目标及后期研究的特点，选择简单、快速、特异性强、目标细胞显色与背景对比较强、易于分辨组织结构的染色方法。而关于常规染色方法的选择，Burton等比较了6种常用染色剂，即1%甲基绿、0．1%核固红、3．6%瑞氏染料、0．2%依文蓝、0．2%亮绿红及2%苏木精的染色效果及对RNA的影响。其判断标准是，经染色后的组织切片既有利于形态学观察，又不影响对切割下来的细胞进行PCR分析，结果显示，甲基绿与核固红最合适，瑞氏蓝次之，苏木精对RNA影响最大。

（二）应用石蜡切片进行LCM

【组织固定】　在包埋前需要对组织进行必要的固定。固定剂的选择与研究对象及研究目的有关。甲醛固定对组织中的DNA有较好的保护作用，而乙醇、丙酮则可以提高组织中RNA的质量及产率。Su等研究发现与新鲜冻存组织相比，70%乙醇固定的脑组织中RNA具有很好的完整性，并且其产率约为前者的70%，捕获后的脑细胞可用于表达谱的研究。同期研究还发现使用甲氧基乙酰苯胺（methacam）固定组织时，RNA产量与DNA产量均可达到比较满意的水平，如脑组织经其固定后，即可进行石蜡包埋，脑组织块以及制备的切片均可在常温下保存。

【切片制备】　切片载体的选择依LCM仪器而定，如LCM专用带EVA膜载片（分不锈钢框架型与玻片型）。为了保证实验效果，使用前可用紫外线照射1h。切片厚度5～8μm，展片后平铺于专用载片上，60℃烤片1h。

【染色步骤】　HE染色是最常用的染色方法之一。由于使用石蜡切片进行LCM时后续实验一般不涉及RNA。因此，HE染色步骤与常规染色相似。对于要切割特定细胞的组织，常需要进行免疫组化染色，并且大部分抗体还需要进行抗原修复，常用方法有微波修复法、压力锅热修复、水浴法。由于LCM所用载体与普通免疫组化染色时不同，部分为EVA膜，使用此膜时，热修复均可产生不同程度的气泡及皱褶，并且更易脱片。为了避免上述问题的发生，部分抗体可以尝试用酶消化法进行修复。