法制备大肠杆菌感受态细胞

实验四　CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞

一、实验目的

学习用化学方法（CaCl₂法）制备大肠杆菌感受态细胞，用于转化实验。

二、实验原理

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状决定的，同时也受到菌龄、外界环境因子的影响。目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl₂处理细菌的方法，即用低渗CaCl₂溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细胞。本方法成功的关键是选用的细菌必须处于对数生长期（因为在这一时期细胞生长最旺盛，接受外源DNA片段的能力最强），实验操作必须在无菌环境和低温下进行。感受态细胞的质量决定转化效率，直接影响基因工程工作的效率。

三、器材和试剂

超净工作台、冷冻离心机、无菌1.5mL管，无菌100mL离心管、移液器吸嘴、微量移液器、托盘天平、冰盒、无菌滤纸、锥形瓶

超纯水:18.2MΩ

CaCl₂:分析纯级

甘油:分析纯级

活化的大肠杆菌DH10B平板、液体LB培养基、预冷0.1mol/L CaCl₂溶液，预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液（含15%甘油）。以上溶液都是在121℃，1.1kg/cm²，灭菌20min，室温保存备用。

四、操作步骤

1.从新活化的大肠杆菌DH10B菌平板上挑取一个单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养12h左右，至对数生长期，将该菌悬液以1∶100～1∶50转接于50mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD₆₀₀数值，至OD₆₀₀＝0.5～0.7时停止培养。

2.将培养液冰上放置10min，于4 000r/min，4℃离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳，均需无菌操作）。

3.倒出培养液，将管子倒扣于无菌滤纸上1min，以使最后的痕量培养基流尽。

4.用10mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液轻轻重悬细胞沉淀，冰浴20min。

5.4 000r/min，4℃离心10min回收细胞。

6.倒出培养液，将管子倒扣于无菌滤纸上1min，以使最后的痕量培养基流尽。加入1mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液（含15%甘油），小心悬浮细胞，冰上放置5min后，即制成了感受态细胞悬液。

7.小心分装，100μL/1.5mL离心管（离心管灭菌，分装前预冷）。

8.制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，或置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

五、影响感受态细胞制备及转化的因素

1.细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经做过多次转接，或储存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×10⁷个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对于大肠杆菌，当OD600为0.5时，细胞密度在5×10⁷个/毫升左右（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密渡过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

2.质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，相对分子质量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较相对分子质量相同的线形重组质粒高10～100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

3.试剂的级别

所用的CaCl₂等试剂均需是高纯度的，并用纯净水配制，最好分装保存于4℃。

4.防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液器吸嘴等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染；否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

5.整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

六、参考文献

［1］　〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版.马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.

［2］　〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.