感受态细胞的制备及转化

实验七　感受态细胞的制备及转化

一、实验目的

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法;掌握质粒转化大肠杆菌细胞的方法。

二、实验原理

转化是指将外源DNA分子导入受体细胞，使宿主获得新的遗传性状的过程，作为受体的E.coli细胞多数为限制-修饰系统缺陷的突变株。

经过一些特殊方法(如电击或CaCl₂等试剂)的处理，可以暂时改变细胞膜的通透性，提高细胞摄取外源DNA的能力，将其诱导为能允许不同来源DNA进入的感受态(competence)细胞。利用载体中的选择标记或外源片段的特性可对含重组DNA的转化子进行筛选和鉴定。

本实验所用的CaCl₂法制备感受态细胞的原理是:在0℃下的CaCl₂低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基-钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理(热休克)，可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型(如Amp抗性)得到表达。然后再涂布于含有抗生素(如氨苄青霉素)的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

三、实验材料

(1)100mmol/L CaCl₂(新鲜配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，预冷至4℃)。

(2)LB培养基(固体，每升含)LB培养基(液体，每升含)

1.03×10⁵Pa蒸汽灭菌20min　　　　　1.03×10⁵Pa蒸汽灭菌20min

四、实验步骤

1.5ml LB液体培养基中接种一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜，至OD₆₀₀＞1，按1%体积比取过夜培养物接种入50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀0.3～0.4。

2.将培养物转入预冷的50ml无菌离心管，冰浴10min。

3.5000r/min 4℃离心5min收集菌体，弃去上清液，并空干残液。

4.将菌体沉淀重悬于10ml预冷的100mmol/L CaCl₂溶液中，混合均匀，冰浴10min。

5.5000r/min 4℃离心5min收集菌体，弃去上清液，空干残液。

6.用2ml预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重新悬浮菌体;混合均匀，置于冰上，得到感受态细胞(留用)(加无菌甘油至20%后，可于－70℃保存半年以上)。

7.用冷却的无菌吸头吸取200μl感受态细胞，转移到预冷的无菌微量离心管中，加入DNA (体积≤10μl，DNA总量＜50ng)，冰浴30min。

8.置于42℃水浴准确保温90s (heatshock)，迅速转入冰浴1 ～2min。

9.加入800μl LB液体培养基，37℃预培养45min (与对照同时进行)。

10.取200μl的预培养物涂布于LB平板(含抗生素，本实验选用50μg/ml氨苄青霉素)，室温放置片刻，待液体渗入培养基后倒置平皿，37℃培养12～16h，对转化子进行计数。

11.取制得的感受态细胞200μl，加入800μl LB液体培养基，37℃预培养45min。再取200μl的预培养物涂布于LB平板［含氨苄青霉素同(10)］作对照。

五、方法评注

20世纪70年代，随着分子克隆技术的出现，基因工程技术也相继发展起来。Mandel和Higa等在1970年就发明了利用氯化钙法将外源DNA导入细菌。我们现在所用的氯化钙方法是Cohen等人于1972年创立的，其转化效率可达到10⁶～10⁷转化子/μg。

将外源基因导入细菌是进行DNA重组操作非常关键的步骤之一;而要使宿主菌能高效转化外源基因，就必须应用高质量的感受态。

六、技术要点

(1)细菌活化之后，生长密度最好保证OD₆₀₀为0.4～0.6，无菌操作;

(2)在－70℃保存感受态细胞;

(3)在进行42℃热休克之前，感受态细胞需在冰上操作;

(4)在以上实验中，每组涂布一个对照平板，涂布两个转化的感受态细胞平板。