实验一 PCR扩增绿色荧光蛋白基因
一、实验目的
通过体外扩增绿色荧光蛋白基因（gfp），了解PCR技术的原理和基本实验操作方法，了解影响PCR反应的关键因素。并为下一步基因克隆操作，提供实验材料。
二、实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1985年发明的一种在体外快速扩增DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，在数小时之内，就可以将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至数百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量、精确复制的DNA拷贝，它是现代分子生物学研究中的一项富有革新型的创举，对整个生命科学的研究与发展都有着深远的影响。
由于PCR技术操作简单、快速、结果可靠，能很容易地使纳克水平的DNA扩增到微克水平，现已发展成为生命科学实验室获取目的DNA片段、基因分析、研究的常规技术，在遗传、癌症等疾病的临床医疗诊断、基因突变与检测、人工定向基因改造、法医学鉴定、生物安全检测等诸多领域都有着广泛的应用，大大推动分子生物学及其相关学科基础与应用研究的发展。
因此，在该技术问世不久，即被科技界的权威杂志——美国Science杂志评为1989年度十大科技进展之一，成为全世界引用频率最高的文献。K.B.Mullis由于在PCR技术方法的杰出贡献，于1993年获得诺贝尔化学奖。
1.PCR技术的发明
PCR技术是在核酸研究的基础上发展起来的。早在1869年瑞士的年轻医生J.F.Miescher就开始对核酸进行研究，至今已有100多年的历史。自1930年正式提出DNA和RNA两种核酸概念后，人们对核酸的化学组成、功能及其结构进行了更为深入的研究，特别是1953年J.Wstson和F.Crick根据X射线衍射图形及各种化学分析数据提出的DNA双螺旋结构及其Crick半保留复制模型，是生物科学史上的一个飞跃，这使得对基因在体外克隆、表达、调控等方面的研究取得了长足的进展，并由此拉开了基因工程的序幕。
20世纪70年代以来，人们采用两种思路建立基因的无性繁殖体系，一是重组DNA技术，它是从基因文库中分离出单个的目的基因，将其拼接到载体中构建重组DNA，因载体是具有独立复制能力的质粒或噬菌体，当重组DNA引入细菌细胞后，经多次复制便可得到足够数量的DNA片段。DNA连接酶和限制性内切酶的发现，为重组DNA技术和基因克隆铺平了道路，现已成为最常用的基因克隆技术。
另一种思路是由H.G.Khorana等在1971年提出的。其观点是，在体外的DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物并不断重复该过程便可克隆目的基因。这种核酸体外扩增的设想由于当时不能合成寡核苷酸的引物和很难进行DNA测序而渐渐为人们所疏忽。利用H.G.Komberg在1958年发现并分离的DNA聚合酶（这是第一个可在试管中合成DNA的酶），美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家K.B.Mullis在1985年发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应，使H.G.Khorana的这一设想终于付诸实现。
PCR的过程类似于DNA的体内复制，只是在试管中进行，通过在体外提供DNA合成的合适条件——模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、Mg2＋、合适的缓冲体系以及周期性的DNA变性、复性及延伸等。1986年PE-Cetus公司在耐热细菌（Thermusaquaticus）中分离到了耐热DNA聚合酶（Taq酶），并于1988年实现了采用基因工程方法大规模生产的耐热DNA聚合酶，为PCR广泛应用奠定了基础。PE-Cetus公司于1987年推出了PCR自动化热循环仪，并于1989年获得了PCR方法、天然Taq酶及重组Taq酶三项专利。
2.PCR技术的原理
应用广泛的PCR技术，其原理并不复杂，与细胞内发生的DNA复制过程十分类似，它是以特定DNA链为模板，以序列特异的寡核苷酸链为引物，以四种脱氧核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的缓冲体系中，按照碱基互补配对原则由DNA聚合酶催化完成的DNA片段体外复制过程。
在PCR反应体系中包括以下成分:
模板DNA:需要被扩增的DNA分子；
引物:根据需要扩增的DNA的序列设计并人工合成，长度约为20个碱基左右的寡核苷酸；
Taq酶:耐热的DNA聚合酶；
dNTPs:A、T、C、G四种脱氧核苷酸；
缓冲液:由Mg2＋、Tris等成分组成，提供Taq酶正常工作所需的pH、金属离子等条件。
PCR反应过程实际上是由三个特定时间长度的温度条件重复25～35次构成。每个PCR循环包括DNA模板变性、引物与模板复性、引物延伸三个步骤。即PCR反应是DNA变性、复性、延伸的不断循环过程，如图3-1所示。
（1）变性 当PCR系统被加热到94℃左右时，双链的模板DNA分子便会发生解链，分离成两条单链的DNA分子，该过程被称为变性，一般持续30s。
（2）复性 然后PCR系统被降温到50～60℃（具体温度视引物序列组成而定），这时引物按照A和T、G和C配对的原则结合到与模板上序列互补的位置，该过程称为复性，一般持续30s。
（3）延伸 然后PCR系统被加热到72℃左右，这时DNA聚合酶从引物的3′端开始并以单链DNA为模板，利用反应体系中的四种dNTPs合成新的DNA互补链。该过程的持续时间视目标DNA片段长度而定，一般Tag酶合成1 000碱基的DNA片段需要1min。
由于在PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反链延伸。这样在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开，并进入下一轮的反应循环，即引物杂交、DNA的合成和双链的分离。PCR反应的最后结果是，经过n次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2n。
图3-1 PCR反应原理示意图
三、器材和试剂
PCR扩增仪、0.2mL无菌PCR管、移液器吸嘴、微量移液器、冰盒。
10×PCR缓冲液（鼎国生物技术公司）、无菌去离子水ddH2O、10mmol/L dNTPs（鼎国生物技术公司）、上游引物GFPf:CAT gCC ATg gTA gAT CTg ACT AgT（上海英俊生物技术有限公司合成）、下游引物GFPr:AgA ATT CAC ACg Tgg Tgg Tgg Tgg（上海英俊生物技术有限公司合成）、模板DNA（上海交大马伟副教授提供）、Taq DNA聚合酶（鼎国生物技术公司）。
四、操作步骤
1.按顺序在0.2mL PCR管中加入
（1）无菌去离子水ddH2O 40μL
（2）10×PCR缓冲液 5μL
（3）10mmol/L dNTPs 1μL
（4）上游引物GFPf（10μmol/L） 1μL
（5）下游引物GFPr（10μmol/L） 1μL
（6）模板DNA 1μL
（7）Taq DNA聚合酶（1U/μL） 1μL
2.混匀后瞬时高速离心，尽量不要有气泡。将PCR管放入PCR仪，设置反应程序。
3.按下列步骤反应
第一步，94℃预变性3min；
第二步，基因扩增，约30～35个循环；
（1）94℃变性反应；30s
（2）50℃退火反应；30s
（3）72℃延伸反应；45s
第三步，72℃延伸反应10min；
第四步，16℃保温。
4.PCR产物于4℃保存，若要长期保存则需放在-20℃。
五、影响PCR的因素
1.模板
一般使用纳克量级DNA为宜，浓渡过高或过低都会影响PCR的效率与准确性。
2.引物
引物是决定PCR结果的关键，需要利用Primer Premier 5等软件进行引物设计。
引物设计的基本原则如下:
①为保证DNA扩增的特异性，引物长度以15～30个碱基为宜。
②G＋C含量约为50%；避免引物内部形成二级结构；两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3′端，避免形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度:Mg2＋浓度会影响Taq酶活性以及复制的特异性，对产量有显著影响。浓渡过高，使反应特异性降低；浓渡过低，使产物产量减少。
④dNTPs浓度:高浓度dNTPs易产生错误掺入；而浓渡过低，势必降低反应产物的产量。PCR反应常用50～200μmol/L，四种脱氧单核苷酸的浓度应相同。
⑤Taq DNA聚合酶用量:在100μL反应液中，一般加入2.5单位的酶量，足以达到每分钟延伸1 000～4 000个核苷酸的掺入速度，酶量过多会产生非特异性产物。
⑥循环参数:常规PCR一般为25～40个周期，随着周期次数增加，Taq DNA聚合酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸数量减少等原因，反应后期容易发生错误掺入。所以在满足产物得率的前提下，应尽量减少周期次数。
六、参考文献
［1］ Mullis KB，Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction.Methods Enzymol.1987；155:335-350.
［2］ 〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版，马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.
［3］ 〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.
［4］ 吴乃虎，等.基因工程原理.2版.北京:科学出版社，1998.
［5］ 彭秀玲，等.基因工程实验技术.2版.长沙:湖南科学技术出版社，1997.
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