绿色荧光蛋白的原核表达

时间：2022-03-08 理论教育版权反馈

【摘要】：绿色荧光蛋白是从海洋中水母体内克隆到的一种蛋白，该蛋白在紫外光的照射下，会发出鲜艳的绿色荧光。2008年10月，绿色荧光蛋白的发现者获得了诺贝尔化学奖。此外，GFP的用途已经扩展到艺术和商务领域，艺术家Eduardo Kac通过把GFP插入兔子细胞内创造出了一只荧光的绿色兔子。育种工作者正在探索利用GFP来创造特殊的荧光植物和各种鱼类，GFP已经被移植到大鼠、小鼠、青蛙、有翅昆虫、蠕虫以及不计其数的其他生物体内。

实验十　绿色荧光蛋白的原核表达

一、实验目的

1.了解绿色荧光蛋白的特性和用途。

2.了解蛋白的表达方法。

二、实验原理

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是从海洋中水母体内克隆到的一种蛋白，该蛋白在紫外光的照射下，会发出鲜艳的绿色荧光。目前，GFP在生命科学研究上有着广泛的应用，因为通过基因工程，可以将GFP与其他蛋白质融合在一起，然后科学家就可以追踪目标蛋白在细胞内部的分布、运动情况。甚至可以把它连接到一种病毒上，那么，我们就可以通过跟踪绿色荧光来观察病毒的扩散途径。总之，GFP作为一种报告基因，可以帮助我们探索微观的分子世界。2008年10月，绿色荧光蛋白的发现者获得了诺贝尔化学奖。

此外，GFP的用途已经扩展到艺术和商务领域，艺术家Eduardo Kac通过把GFP插入兔子细胞内创造出了一只荧光的绿色兔子。育种工作者正在探索利用GFP来创造特殊的荧光植物和各种鱼类，GFP已经被移植到大鼠、小鼠、青蛙、有翅昆虫、蠕虫以及不计其数的其他生物体内。当然这些转基因植物和动物还存在一些争议，并且已经引发了关于基因工程安全性和伦理性的重要讨论。

在实验中，我们将利用GFP来观察外源基因在大肠杆菌表达。在紫外光照射下，含有GFP基因的质粒成功转化的菌落（重组子）就会发出绿色荧光，而未转化的菌落则没有荧光，从而可以非常方便地鉴定出重组转化子。

三、器材和试剂

超净工作台、水浴锅、凝胶成像仪、恒温振荡器、恒温培养箱、移液器吸嘴、微量移液器、1.5mL无菌离心管、培养皿、酒精灯、三角推棒、冰盒

重组质粒pET-GFP、受体菌E.coli B121（DE3）、卡那霉素、IPTG、LB琼脂平板（含卡那霉素、IPTG）

四、操作步骤

1.观察法

（1）分别用1μL重组质粒pET-GFP、1μL pET-28a转化受体菌E.coli B121（DE3），操作步骤参照实验五。

（2）分别在转化pET-GFP和pET-28a琼脂培养板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中（含卡那霉素），37℃，200r/min，振荡培养过夜。

（3）各取1mL细菌过夜培养物（种子培养液）接种于50mL新鲜LB培养基（含卡那霉素）放大培养，37℃，200r/min，振荡培养至OD600＝0.6～0.8左右。

（4）向上述培养液中加入IPTG（终浓度为0.5～1mmol/L），继续放入恒温振荡器中，30℃，200r/min，振荡培养2～4h。

（5）观察培养液颜色变化，在紫外灯下观察并记录结果。

（6）取1mL pET-GFP绿色表达培养液，用灭过菌的牙签棒蘸取菌液涂布在含有卡那霉素、IPTG的LB琼脂板上，绘制创意平板。涂布一次，描写两次，待液体完全吸收后，将培养皿放于37℃恒温培养箱倒置培养12～16h。