原核生物复制的起始

起始是复制中较复杂的环节，包含了母链DNA解链形成复制叉，进而形成引发体及合成引物。

（一）DNA解链

复制的起始通常是有固定的复制起始点，大肠埃希菌上有一个固定的复制起始点，称为oriC。oriC跨度为245bp，碱基序列分析发现这段DNA上有3组串联重复序列和2对反向重复序列（图9－5）。上游的串联重复序列称为识别区；下游的反向重复序列碱基组成以A、T为主，称为富含AT（AT rich）区。DNA双链中，AT配对多的部位容易解链，因为AT配对只有2个氢键维系，而GC配对有3个氢键。

猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）是迄今为止研究得最为详尽的乳多空病毒（papova virus）之一。SV40的基因组是一种环形双链的DNA，其复制起始点也同样具有两组反向回文序列，以及富含AT区。

图9－5 复制起始点特征（a）大肠埃希菌；（b）SV40

复制起始时，需多种酶和辅助的蛋白质因子，共同解开、理顺DNA链，并维持DNA分子在一段时间内处于单链状态（表9－1）。

表9－1 原核生物复制起始的相关蛋白质

大肠埃希菌DNA复制起始的解链是由DnaA、DnaB、DnaC共同参与的。复制起始时， DnaA辨认并结合于串联重复序列（AT区）上。然后，几个DnaA互相靠近，形成DNA蛋白质复合体，可促使AT区的DNA进行解链。DnaB为解旋酶（helicase），利用ATP供能解开DNA双链（图9－6a）。在DnaC的协同下，DnaB结合并沿解链的方向移动，使双链解开足够用于复制的长度，并且逐步置换出DnaA。此时，复制叉初步形成，单链结合蛋白（SSB）也结合到解开的单链上，在一定时间内使复制叉保持适当的长度，有利于核苷酸依据模板参入（图9－6b）。

图9－6 多种蛋白和酶参与DNA解链和稳定单链

（a）解旋酶；（b）单链结合蛋白

解链是一种高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象。此时由DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase），可能主要是Ⅱ型酶作用，在将要打结或已打结处作切口，下游的DNA穿越切口并作一定程度旋转，把结打开或解松，然后旋转复位连结。这样解链就不会因打结的阻绊而继续下去。即使不出现打结现象，双链的局部打开，也会导致DNA超螺旋的其他部分过度拧转，形成正超螺旋（图9－7）。

DNA双螺旋沿轴旋绕，复制解链也沿同一轴反向旋转，高速复制导致旋转达100次/s，造成DNA分子打结、缠绕、连环现象。闭环DNA按一定方向扭转会形成超螺旋，如同一橡皮圈沿相同方向拧转。通常DNA分子的拧转是适度的，而盘绕过分称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋。复制时，部分DNA要呈松弛状态，就好像已拧转的橡皮圈中打开中间一段就会引起其余部分过度拧紧而变为正超螺旋。复制中的DNA分子也会遇到这种正、负超螺旋及局部松弛等过渡状态。上述这些，均需拓扑异构酶作用，以改变DNA分子的拓扑构象，理顺DNA链来配合复制进程。

图9－7 大肠埃希菌复制起始部位的解链

拓扑异构酶对DNA分子的作用是既能水解，又能形成磷酸二酯键。拓扑酶异构Ⅰ的催化反应不需ATP，它可以切断DNA双链中的一股，使DNA解链旋转中不致打结，适当时候又把切口封闭，使DNA变为松弛状态。拓扑异构酶Ⅱ在无ATP时，切断处于正超螺旋状态的DNA分子双链某一部位，断端通过切口使超螺旋松弛；在利用ATP供能情况下，松弛状态的DNA又进入负超螺旋状态，断端在同一酶催化下连接恢复。这些作用均使复制中的DNA能解结、连环或解连环，达到适度盘绕。此外，母链DNA与新合成链也会互相缠绕，形成打结或连环，也需拓扑异构酶Ⅱ的作用。

DNA拓扑异构酶（图9－8）广泛存在于原核及真核生物，分为Ⅰ型和Ⅱ型两种，最近还发现了拓扑异构酶Ⅲ。原核生物拓扑异构酶Ⅱ又叫促旋酶（gyrase），真核生物的拓扑异构酶Ⅱ还可分为几种亚型。拓扑异构酶通过切断、旋转和再连结的作用，把正超螺旋变为负超螺旋，实验证明负超螺旋比正超螺旋有更好的模板作用，这可能是因为扭得不那么紧的超螺旋比过度扭紧的更容易解开成单链。

图9－8 DNA拓扑异构酶

（二）引发体和引物

由于已经发现的DNA复制酶都不能从头合成，即不具备催化两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键的能力，只能催化核酸片段3′－OH末端与dNTP之间的聚合，所以复制过程需要引物（primer）。引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。当在DNA复制起始点已经完成解链，此时引物酶进入，形成含有解旋酶（DnaB）、DnaC、引物酶（即DnaG）和DNA的起始复制区域的复合结构，称为引发体。

引发体的蛋白质组分在DNA链上移动，需由ATP供给能量。在适当位置上，引物酶依据模板的碱基序列，从5′→3′方向催化NTP（不是dNTP）的聚合，生成短链的RNA引物。引物长度约为十几个至几十个核苷酸不等。引物合成的方向也是自5′→3′，已合成的引物必然留有3′－OH末端，为DNA复制酶提供3′－OH，新链每次反应后亦留有3′－OH，复制就可进行下去。