药物制剂的微生物学检查

课堂笔记

药物制剂的微生物学检查主要包括无菌检验、细菌总数测定、真菌总数测定以及病原菌的检验与螨的检测等。

一、无菌制剂的无菌检查

无菌检查是指检查药物制剂是否含有活的微生物的一种方法。各种注射剂（如针剂、输液等）、手术眼科制剂都必须保证绝对不含有任何活的微生物才视为合格，有关具体的无菌检查方法在我国药典中有明确的规定。

（一）无菌检查的基本原则

无菌检查的基本原则是采用严格的无菌操作方法，将被检查的药品取一定量分别接种于适合各种微生物生长的不同培养基中（通常为需氧菌培养基、厌氧菌培养基和真菌培养基），置适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断被检药品是否合格。由于无菌检查是用部分样本的结果推断整体的含菌情况，故被检药品的取样及程序必须按照国家药典的规定进行。

（二）无菌检查的基本方法

1．一般药品的无菌检查　一般药品的无菌检查法属于直接接种法，即将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时以同样的培养基做阳性对照试验。

检品如是液体，可直接加入培养基中；如是固体药物，按规定加入一定量的无菌生理盐水或无菌水使药物溶解成均匀的检品溶液，然后进行无菌检查。

2．特殊药品的无菌检查法　如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。

（1）油类药物的无菌检查：一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的微生物不易生长，所以一般可采用吐温培养基，其余同一般药品无菌检查法。

（2）抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查：如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及试验管均可能不长菌。因此在进行无菌检查前必须采用一些方法除去药物本身的抗菌作用，然后再依上述方法进行无菌检查。

①加入灭活剂：在培养基中加入合适的灭活剂（或称对消剂），去除或抵消抗菌药物的抗菌作用。

②微孔滤膜法：被检药品先加入无菌生理盐水稀释，然后用无菌微孔滤膜器（孔径为0．22～0．45μm）过滤，用无菌生理盐水充分洗涤后，取出滤膜，分成若干片分别放入各种培养基中进行检查。

③稀释法：首先测出被检药品的最小抑菌浓度（MIC），然后将药品移种入大量培养基中（所用培养基量根据药物原始浓度和MIC而定），使药品稀释至不具有抑菌作用的浓度进行检验。

④离心沉淀法：取规定量的供试液，离心（3　000r／min） 30min，弃去上清液，留底部浓缩菌液约2ml，再稀释成一定量进行检验。

二、口服药及外用药物的微生物学检查

口服药及外用药，在生产和临床使用过程中，虽不要求达到完全无菌，但是为了保证药品的质量，防止药品的污染，必须保证不含有病原微生物及过量的微生物，即需要限制性控制微生物的数量和种类。

目前对口服药及外用药物的微生物学检验主要是微生物限量检验，即限制口服药及外用药的微生物总数和限制病原微生物种类的系列测定项目。我国规定的项目有：细菌总数测定、真菌总数测定、病原菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌）的检验和活螨的检验等。

（一）细菌总数的测定

测定方法采用琼脂倾注平皿计数法。取一定量的供试药物以无菌生理盐水按比例进行系列稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿中，再加入一定量的已融化的、温度在55℃左右的琼脂培养基混匀，凝固后，37℃培养24～48h，计数平板内菌落。一般选取菌落数在30～300的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即可得每克或每毫升供试药物中的活菌总数。

（二）真菌和酵母菌总数的测定

使用适合真菌生长的虎红培养基。在25～28℃培养72h（也可在24、48和72h分别计数），选取平皿中生长的菌落数在5～50个范围为宜，乘以稀释倍数，即可得单位重量（或体积）中的真菌总数。

（三）病原菌的检验

1．大肠埃希菌　大肠埃希菌是口服药品的常规必检项目之一。检验要点如下。

（1）形态：革兰阴性短小无芽胞杆菌。

（2）分离培养：在伊红美兰（eosin methylene blue，EMB）培养基上分解乳糖，产生紫黑色、有金属光泽的菌落。

（3）生化反应：乳糖发酵试验示产酸产气或产酸不产气；IMViC试验示＋＋--，注意与产气杆菌区别。

2．沙门菌　沙门菌被列为口服药品的必检项目。检验要点如下。

（1）形态：革兰阴性短小杆菌。

（2）分离培养：SS琼脂上，沙门菌不分解乳糖，产生H2S，菌落无色、透明或半透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上菌落呈无色或粉红色。三糖铁培养基（triple sugar iron，TSI）上分解葡萄糖、可产酸产气，不分解乳糖、蔗糖，有动力、产生黑色沉淀。

（3）血清学反应：用可疑菌作为抗原，沙门菌A～F组的多价血清作为抗体进行玻片凝集反应，并以生理盐水做对照试验。

3．铜绿假单胞菌　铜绿假单胞菌是条件致病菌，一般眼科制剂和外伤用药中不得检出铜绿假单胞菌。检验要点如下。

（1）形态：革兰阴性短杆菌。

（2）分离培养：在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上菌落扁平，无定形，湿润，周边扩散或略有蔓延，灰白色，培养基上扩散有水溶性绿色色素。

（3）生化反应：氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验阳性，可报告检出铜绿假单胞菌。如绿脓菌素阴性，则须明胶液化试验阳性、硝酸盐还原产气试验阳性、42℃生长试验阳性才可报告被检品检出铜绿假单胞菌。

4．金黄色葡萄球菌　金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病力最强的一种菌，是人类食物中毒症的常见病原体之一。检验要点如下。

（1）形态：革兰阳性球菌，葡萄状排列。

（2）分离培养及生化试验，如分离培养的可疑菌，甘露醇和血浆凝固酶试验均为阳性，则可判断为检出金黄色葡萄球菌。

5．破伤风梭菌　用于深部组织、创伤和溃疡面的外用制剂不得检出破伤风梭菌。检验要点如下。

（1）形态：革兰阳性芽胞梭菌，菌体细长，带芽胞的菌体呈鼓槌状。有周鞭毛，能运动，不形成荚膜。

（2）分离培养：葡萄糖疱肉培养基中生长，消化肉渣，使肉渣变黑，有特殊臭味。新霉素葡萄糖血平板上菌落蔓延生长，雾状、细丝状或羽毛状，边缘不整齐，常有β溶血环。

（3）毒力试验：小白鼠皮下注射菌液，6～48h观察发病情况。出现典型的破伤风病症的，判定为阳性。

（四）活螨的检验

螨是一种小形的节肢动物，可污染药物制剂，使之变质失效。

活螨的检查方法一般有：直检法、漂浮法和分离法三种，最后都在显微镜下观察有否活动的螨，如有，即可判断检品检出活螨。

重点难点提示

熟悉不同药物制剂的微生物的检验要求和基本方法。

测试及考研

简答题

目前我国对口服药及外用药物的微生物学检验项目及标准有哪些？

答案：

我国规定的项目有：细菌总数测定、真菌总数测定、病原菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌）的检验和活螨的检验等。判断合格与否的标准是：口服药及外用药中微生物总量须低于规定限量外，并须在口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、沙门菌；外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风梭菌；此外均不得检出活螨。

（徐慰倬）