实验十二血凝素基因的原核表达
一、实验目的
掌握原核表达蛋白的方法。
二、实验原理
E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度或者诱导物等的诱导，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质。提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。诱导表达后可通过SDS-PAGE电泳来检测表达蛋白质。
细菌裂解的常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法则在实验室研究中应用较为广泛。
酶溶法中常用的溶解酶有溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶、糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
而超声波破碎法的原理是声频为15～20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。
三、实验材料
1.诱导表达材料
(1)LB (Luria-Bertani))培养基(见实验七)。
(2)IPTG储备液:2g IPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，－20℃保存。
(3)1×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，50mmol/L DTT，2% SDS(电泳级)，0.1%溴酚蓝，10%甘油。
2.大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
(1)酶溶法
①裂解缓冲液:50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L naCl。
②50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。
③10mg/mL溶菌酶。
④脱氧胆酸。
⑤1mg/mL DNase I。
(2)超声破碎法
①TE缓冲液。
②2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，100mmol/L DTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油。
四、实验步骤
1.外源基因的诱导表达
取上一个实验验证后的细菌进行下面实验。
(1)从平板上挑取单菌落，接种于5mlLB液体培养基中培养过夜，
(2)按照1∶50～1∶100的比例接种，37℃培养细菌数小时达到对数生长期后，取1ml备用，其余加IPTG至终浓度为1 mmol/L。继续培养3～5h。
(3)每小时取上述培养液1ml，1000g离心1min，取沉淀，加100μl聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS-PAGE检测(具体操作步骤见实验十六)(图12-1)。
图12-1 大肠杆菌原核表达
表达前;2.诱导表达2h;3.诱导表达4h)
2.大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
(1)酶溶法
①4℃，5000r/min离心15min，收集诱导表达的细菌培养液(100ml)。弃上清液，约每克湿菌加3ml裂解缓冲液，悬浮沉淀。
②每克菌加8μl PMSF及80μl溶菌酶，搅拌20min;边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸(在冷室中进行)。
③37℃，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时每克菌加20μl DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。
(2)超声破碎法
①收集1L诱导表达的工程菌，40℃，5000r/min离心15min;弃上清液，约每克湿菌加3ml TE缓冲液。
②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌;10000g离心15min，分别收集上清液和沉淀。
③分别取少量上清液和沉淀，加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。
注意事项:
超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握;超声波破菌前，标本经3～4次冻溶后更容易破碎。
五、方法评注
细菌质粒是一类双链闭环的DNA分子，它们可以利用宿主的酶和蛋白质进行独立复制和遗传。表达载体一般都含有强的启动子和有效的核糖体结合位点，当外源基因编码序列定向克隆入这些载体的多克隆位点之后，在适当的条件下(如温控诱导、化学诱导)诱导表达，就可产生目的蛋白质。这样表达的蛋白绝大多数为融合蛋白。融合表达具有高表达，高稳定性(相对于天然蛋白质)以及易鉴定和纯化等优点。
六、技术要点
(1)单菌落首先要进行活化，然后才能进行诱导表达;
(2)诱导表达时，菌液的生长状态非常重要，一般要求细菌处于对数生长期，可以检测菌液的OD600值，一般要求OD600nm在0.5～0.7;
(3)诱导温度，时间和IPTG的浓度对表达有很大的影响，可以影响外源蛋白质在宿主菌中的表达形式。如有些蛋白质需要在低温下(如20℃诱导)才能得到可溶性的表达。
附
1.包涵体的分离
蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成在相差显微镜下可见的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白质，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。
(1)试剂与配制
①洗涤液I:0.5% Triton X 100，10 mmol/L EDTA (pH8.0)溶于细胞裂解液中。
②2×凝胶电泳加样缓冲液。
(2)细胞裂解混合物12000g离心15min，4℃;弃上清液，沉淀用9倍体积洗涤液I悬浮;室温放置5min，12000g离心15min，4℃;吸出上清液，用100μl水重新悬浮沉淀;分别取10μl上清液和重新悬浮的沉淀，加10μl2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDSPAGE。
2.包涵体的溶解和复性
(1)试剂与配制
①缓冲液I:1 mmol/L PMSF，8mol /L尿素，10 mmol/L DTT溶于裂解缓冲液中。
②缓冲液Ⅱ:50 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EDTA (pH8.0)，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L还原型谷胱甘肽，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽
③KOH和HCl。
④2×凝胶电泳加样缓冲液。
(2)用100μl缓冲液I溶解包涵体;室温放置1h;加9倍体积缓冲液Ⅱ，室温放置30min，用KOH调到pH 10.7;用HCl调至pH8.0，在室温放置至少30min; 1000g离心15min，室温;吸出上清液并保留，用100μl2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀;取10μl上清液，加10μl2×凝胶电泳加样缓冲液，与20μl重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE。
注意事项:
①不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。
②表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。
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