原核生物复制的延长

复制的延长是在DNA聚合酶催化下完成的，遵照碱基互补原则，以解开的母链为模板， dNTP逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

DNA聚合酶全称是依赖DNA的DNA聚合酶（DNA－dependent DNA polymerase， DNA pol）。大肠埃希菌有5种DNA pol，都有5′→3′延长脱氧核苷酸链的聚合酶活性，其中主要的3种DNA pol的特点见表9－2。DNA pol Ⅳ和DNA polⅤ于1999年被鉴定，主要参与非常规的DNA修复。

表9－2 原核生物的DNA pol

DNA polⅢ的比活性远高于polⅠ，每分钟可催化多至105次聚合反应。DNA polⅢ是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶，而DNA polⅠ的主要功能是对复制中的错误进行校对，对复制和修复中的空隙进行填补。DNA polⅠ可被水解为2个片段，小片段共323个氨基酸残基，有5′→3′核酸外切酶活性；大片段共604个氨基酸残基，又称Klenow片段，具有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性，常用于实验室合成DNA和标记探针等。DNA polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，也能催化核苷酸聚合，它主要参与DNA损伤的应急修复。

DNA polⅢ是由10种亚基组成的不对称异源二聚体（图9－9）。α、ε、θ组成核心酶，兼有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性。ε亚基为复制保真性所必需（图9－10）。两边的β亚基像一个夹子使核心酶固定在模板链，并使酶沿模板滑动。其余的亚基统称γ－复合物，有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用。

原核生物催化延长反应的酶是DNA polⅢ，分别催化前导链和后随链延长。底物dNTP的α－磷酸与引物或延长中的子链上3′－OH反应后，dNMP的3′－OH又成为链的末端，使下一个底物可以参入。复制沿5′→3′延长，指的是子链合成的方向，不论前导链还是后随链的子链均沿着5′→3′方向延长。

图9－9 （a）大肠埃希菌DNA polⅢ全酶分子结构；（b）DNA polⅢ结合在DNA上

图9－10 （a）DNA polⅢ校对时分子结构变化；（b）校对时发生的化学反应

在同一个复制叉上，前导链的复制先于后随链，但两链的DNA polⅢ均是沿着母链解链的方向移动。这是因为后随链的模板DNA可以折叠或绕成环状，由于后随链做360°的绕转，前导链和后随链的生长点都处在DNA polⅢ核心酶的催化位点上（图9－11）。解链方向就是酶的前进方向，亦即复制叉从已解开向待解开片段伸展的方向。复制叉上解开的模板单链走向相反，后随链出现不连续复制的冈崎片段。

前导链的延长是连续的，而后随链在延长的过程中产生了许多冈崎片段。每个冈崎片段上的引物是RNA而不是DNA。要完成后随链的合成还必须去除RNA引物并填补引物留下空隙，最后把DNA片段连接成完整的子链（图9－12）。此过程由DNA polⅠ和DNA连接酶完成。DNA polⅠ具有的5′→3′核酸外切酶活性去除掉5′－端的RNA引物，并利用相邻冈崎片段的3′－OH继续合成DNA填补RNA引物切除后的空缺，延伸到一定长度后还是留下相邻的3′－OH和5′－P的缺口（nick），最后由DNA连接酶完成缺口的连接。按照这种方式，所有的冈崎片段在环状DNA上连接成完整的DNA子链。前导链也有引物水解后的空隙，在环状DNA最后复制的3′－OH末端继续延长，即可填补该空隙及连接。

图9－11 大肠埃希菌的复制体

图9－12 （a）前导链的延长；（b）后随链的合成

DNA复制延长速度相当快。以大肠埃希菌为例，营养充足、生长条件适宜时，细菌20min即可繁殖一代。大肠埃希菌基因组DNA全长约3 000kb，依此计算，每秒钟能参入的核苷酸达2 500个。