扩增目的基因

实验九　多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因

一、实验目的

学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:

PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1.变性:加热使模板DNA在高温下(94～95℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，使下一步引物可以结合上去，即变性阶段。

2.退火:在体系温度降至37～65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与互补的模板链结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。退火温度根据具体的两对引物的Tm值决定，一般选用一对引物中较低Tm值减去5，也可进行温度梯度实验确定最适退火温度。

3.延伸:体系反应温度升至耐热DNA聚合酶的最适反应温度72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5'到3'方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

图9-1　PCR原理

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10⁶～10⁹倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl₂、两条合成的DNA单链引物、耐热DNA Taq聚合酶，去离子水。

PCR方法可用于制备探针。在PCR过程中，加入生物素标记的dUTP，可以取代dTTP掺入到新合成的目标序列中，带有生物素标记的PCR产物就可以作为探针，与目标基因组DNA杂交，由此定位含有该片段的基因。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:微量移液器，枪头(10μL、200μL)，枪头盒，离心管(200μL)，PCR仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统。

2.材料:模板DNA(实验一所得的花生基因组DNA)。

引物:DOF:S162　5'AAATTCTGCTACTACAAC3'TM51℃

　　　　　A466　5'CAGGGAAAGAAGGTAGGT3'TM54℃

3.试剂:dNTP、TaqDNA聚合酶从公司采购。

四、实验步骤

1.模板DNA的抽提:实验一所得的花生基因组DNA。

2.PCR操作(在冰上操作):

(1)PCR反应混合液的配制:反应体系25μL，在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样:

制备探针时，dCTP，dATP，dGTP各加0.05μL，另加0.05μL生物素标记的dUTP。

(2)将反应混合液混匀，瞬时离心使所有液体汇集在管底，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发。

3.PCR产物的检测:

参照附录1:琼脂糖凝胶电泳分离技术

4.PCR产物与T-载体直接连接过夜(参照实验六)。实验需要约4h。

五、结果与分析

以两个不同品种花生基因组DNA为模板进行PCR，得到的产物带型不同，如图9-2所示。其中品种L1的一条约300bp的带分子量更接近引物设计所根据的DOF cDNA序列大小，而且很亮，说明引物专一。可能这段产物与原始序列更相似。

图9-2　DOF基因的PCR电泳图

六、注意事项

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作他用。

1.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

2.每加一种反应物，应换新的枪头。

3.制备PCR反应液时应注意所有样品取样准确，而且要加到管的底部。

4.加完后混匀，再瞬时离心，然后进行PCR反应。反应结束时也要瞬时离心后再取样电泳。

七、思考题

1.PCR反应液中主要成分是哪些?在PCR反应过程中各起什么作用?

2.为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化?

3.用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项?

4.制备探针时，为何要加生物素标记的dUTP?