琼脂糖凝胶电泳分离

【实验目的】

掌握琼脂糖凝胶电泳技术，了解其应用。

【实验原理】

琼脂糖是D－半乳糖和3，6－脱水－L－半乳糖构成的线状高聚物。琼脂糖主要通过氢键形成网孔凝胶。DNA分子在pH　8．0时带负电荷，向正极移动。琼脂糖凝胶中的DNA分子在电场中除电荷效应外，还有分子筛效应，并与DNA分子大小及构象有关。线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比。在凝胶中加入的少量溴化乙锭（ethidium bromide，EB）可插入DNA碱基之间，并产生荧光，在紫外光下观察DNA片段在凝胶中的位置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胺浓度关系见附表11。

附表11　线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系

【实验器材】

水平电泳槽；电泳仪；紫外透射仪或凝胶成像系统；微波炉或水浴锅。

【实验试剂】

1．电泳缓冲溶液（1×TAE）　取4．84g Tris，1．1ml的冰乙酸，2ml　0．5mol／L EDTA（pH　8．0）加三蒸水至1　000ml。

2．溴化乙锭（10mg／ml）　称取溴化乙锭10mg溶于1ml蒸馏水中备用。

3．1%琼脂糖。

4．电泳上样缓冲溶液（6×）0．25%溴酚蓝，0．25%二甲苯腈，40%（W／V）蔗糖水溶液，4℃保存。

5．DNA marker。

【实验方法】

1．1%琼脂糖凝胶制备　称取0．2g琼脂糖，加1×TAE电泳缓冲液20ml，加热溶解。待冷却到50℃时，小心加入2μl EB，混匀。倒入凝胶模具中，在模具一端插入梳子。待胶凝固后小心拔除梳子。将凝胶放入电泳槽中（加样孔端放在阴极）。

2．DNA样品处理　在DNA样品中，按1∶6的比例加入6×电泳上样缓冲溶液。

3．加样　将处理过的DNA样品加到样品孔中。

4．电泳　接通电源，1～5V／cm（两电极间距离）。根据示踪剂迁移的距离，判断是否终止电泳。

5．DNA片段观察　电泳结束后，取出凝胶，在紫外灯下或凝胶成像系统观察DNA片段大小或拍照。

【注意事项】

溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性。使用含有该染料的溶液时必须戴手套。使用完后进行净化处理。

（田余祥）