自体富血小板凝胶

自体富血小板凝胶(autologous platelet-rich gel,APG)系取自患者外周静脉血,经2次离心、分离、浓缩制得的富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),将其按10∶1比例(体积比)与凝血酶-钙剂混合凝固而形成的凝胶状物质,其成分包括富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)、白细胞及凝血酶(人或小牛)、钙剂,故又称自体富血小板-白细胞凝胶(autologous platelet-leukocyte gel,APLG)。其不仅具有加速止血、封闭创面的特点,而且含有丰富的生长因子,能加速创面愈合。

自20世纪70年代开始试用自体血浆纤维蛋白凝胶以促进手术伤口愈合以来,各种自体血浆凝胶开始广泛用于骨科、烧伤整形外科、口腔科等创面的治疗,而新近发展的APG治疗技术能明显促进创伤及溃疡组织修复和再生,促进伤口愈合。自1997年Whiteman等首次将APG用于口腔颌面外科治疗以来,目前已在口腔颌面外科、烧伤整形科、骨科等领域广泛应用,且在创伤修复领域已经对APG进行广泛的基础和临床研究。直到2004年,Saldalamacchia等才开始将APG用于治疗糖尿病足溃疡,发现其疗效明显好于标准治疗组。在我国,四川大学华西医院糖尿病足诊治中心于2005年在国内率先将该技术应用于糖尿病足溃疡的治疗。

1.制备方法　临床上若要应用APG治疗糖尿病足溃疡,其关键是APG的制备,而APG制备的核心环节是PRP的制备,其制备原理是通过密度梯度离心法从全血中分离血小板。

PRP系取自患者的外周静脉血,经2次离心、分离、浓缩制得富含血小板血浆,其成分包括血小板、白细胞、血浆以及少许红细胞,亦称为富生长因子血小板、自体浓缩血小板等。目前有两种方法制备PRP,即血浆分离置换法(plasmapheresis method)和离心分离法,而理想的方法是制备的PRP具有更高的血小板数量和血小板回收率。

(1)血浆分离置换法:是利用多功能医用血成分自动分离设备(如自体血小板分离机)通过预设的程序在一个封闭系统中离心2次得到PRP或浓缩血小板,其PRP的浓度是可变的。Daniel等率先使用血小板分离机(SmartPReP Autologous Platelet Concentrate System)制备PRP并用于整形外科手术切口,取得较好的效果;加拿大学者使用血小板分离机PCCS(platelet concentrate collection system)制备PRP,可使血小板浓度增加5.5倍。宋扬等通过改良法制备PRP时使用自制的设备,2次离心在同一个容器内完成,简化了程序和污染的机会,制得PRP血小板数量为1192.88×109/L(8.55倍),血小板回收率为59.88%。此法自动化程度高,操作简便、迅速,不易污染,可控制性好,安全高效,制得的PRP中血小板纯度和浓度均高,具有良好的应用前景。但该方法需血量相对较大,一般在150　ml以上或需建立静脉循环通道,采集血小板后对其他血成分进行回输。此外,该设备价格昂贵,也限制了其在临床上的广泛应用,目前主要在血库进行血小板的采集用于成分输血。

(2)离心分离法:人工操作分离PRP差异较大,血小板浓度也不一样。笔者的研究发现,先以2000转/分钟离心4分钟,用巴氏管吸取上部的血浆及靠近界面1　mm的红细胞转移到另一离心管中;再以4000转/分钟离心6分钟,可见在底部薄层的红细胞上沉积有白膜样物质,即为血小板沉积层,其上部为含有极少量未沉降血小板的血浆层,用巴氏管吸取上部大部分血浆,剩余部分血浆及血细胞成分,然后再静置30分钟后轻轻振摇离心管,使红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中,即得到PRP;此法制备的PRP,其血小板数量最高为1363.80×109/L,比离心前提高5.91倍,血小板回收率为75.2%;袁霆等研究发现有2种方法,即取外周血20　ml,第1次以1600转/分离心10分钟,吸取上清液及交界面下3　mm,第2次以1600转/分离心10分钟;或第1次以1600转/分离心10分钟,第2次以3200转/分离心10分钟;以1500转/分离心6分钟;所得血小板浓度分别为1323.80×109/L和1　347.05×109/L。制备PRP的离心方法较多,在临床上可根据自己的需要选择不同的离心方法。离心分离法制备PRP对设备要求低,步骤简单,但以下缺点限制了其在临床上的推广应用:①在开放的系统内制备容易受外界的污染;②多个容器中转移,增加血小板激活和被污染的机会;③血小板回收率相对较低;④易受操作因素的影响,制备的PRP相关指标变异系数较大。

APG的制作过程必须在无菌状态下完成,所有试剂和工具均在消毒有效期内使用,PRP分离操作间在操作前紫外线消毒。APG制备的流程和主要步骤见图17-1和图17-2。

2.临床应用　Krupski WC等通过前瞩性、随机双盲安慰剂对照研究,对慢性难治性皮肤溃疡(包括糖尿病神经性溃疡)在常规治疗的基础上采用APG治疗和安慰剂治疗,结果发现经治疗12周后,两组间的治愈率分别为24%和33%,提示APG治疗组并没有比安慰剂组获得更多的益处;但Crovetti等使用APG治疗慢性皮肤溃疡24例,其中9例为糖尿病溃疡,治疗后发现局部肉芽组织生长明显加快,所有患者均有完整的上皮形成,并且治疗后局部疼痛明显减轻;David等用APG治疗糖尿病神经性溃疡与传统治疗组相比,治疗组所治疗患者的皮肤溃疡在治疗前比对照组溃疡面积更大,开放时间更久,溃疡评分更高;治疗32周后观察,治疗组的溃疡治愈率显著高于对照组,并且患者普遍易于接受APG治疗;Driver等通过前瞻性、随机对照研究,将符合纳入标准的72例糖尿病足溃疡患者随机分为治疗组和对照组,每2周进行一次溃疡评估,疗程为12周。治疗后APG组68.4%的患者溃疡愈合,而对照组仅有42.1%的患者溃疡愈合;在校正了溃疡面积大小后,APG组81.3%的患者溃疡愈合,而对照组仅有42.1%的患者溃疡愈合(P=0.036,Fisher确切概率法),Kaplan-Meier时间愈合曲线显示两组有显著性差异(log-rank,P=0.017　7),且未发现有与治疗相关的严重不良事件发生。笔者的随机对照研究显示,治疗组在12周的观察期内溃疡愈合率达89.13%,而标准治疗组仅为71.15%,两组总有效率分别为95.65%和73.08%;溃疡愈合时间生存分析提示,标准治疗组的溃疡不愈合率明显高于APG治疗组,换言之,随着治疗时间的延长,APG治疗组的愈合率明显高于标准治疗组;溃疡愈合速度明显快于对照组,溃疡愈合时间分别为36天和48天。此外,APG在难治性皮肤溃疡窦道的封闭治疗中具有更明显的优势,皮肤溃疡的窦道封闭时间生存分析提示,APG治疗对窦道的封闭率明显优于标准治疗;两组间的治疗费用没有显著差异;在治疗期间,有18例患者(APG组12例,对照组6例)出现蚁行感或针刺样感觉,但不久之后症状自然消失,未发现其他严重不良事件发生;痊愈患者经过长达(37.49±10.21)个月的随访,APG组患者5例死亡,对照组患者死亡8例,两组患者分别有6例溃疡复发,提示APG在治疗难治性糖尿病皮肤溃疡中是经济、有效、安全且可行的。图17-3是一例86岁、左足背溃疡1个月余的男性患者,入院后经APG治疗71天痊愈出院的愈合过程。

图17-1　离心分离法制备APG流程

图17-2　APG的制备过程
A.抽取外周静脉血注入50　ml离心管;B.将离心管放入离心机中离心;C.第1次离心后红细胞与血浆分离,吸取上层血浆继续离心;D.第2次离心后血小板和少量红细胞位于离心管底部;E.吸出上层血浆,将下层血浆和血小板及白细胞混匀后吸入10　ml注射器中即为PRP;F.将所得PRP与凝血酶-钙剂以10∶1的比例混合即得APG

3.注意事项　APG在治疗糖尿病皮肤溃疡方面表现了良好的效果,但并不是任何情况下使用APG治疗糖尿病皮肤溃疡均能获得成功。使用APG治疗时应注意,APG治疗需建立在糖尿病基础治疗和溃疡局部处理综合治疗的基础之上,如控制高血糖、高血脂、高血压;积极治疗伤口局部的感染,及时对溃疡表面的分泌物进行培养,并根据药敏实验结果选用抗生素;对局部伤口进行彻底清创,将已经坏死的组织和胼胝尽量清除,保持溃疡面平整、清洁,对于较深的窦道或趾缝间等常规清除困难的部位可以使用超声刀等工具辅助清创,消除溃疡周围皮肤水肿;注意患肢减压;正确评估溃疡肢体的血供情况,溃疡部位缺血严重者要改善局部血供,使用血管旁路手术或血管腔内微创手术解除远端供血不足以及改变不良生活习惯(如吸烟,饮食等)。在此综合治疗的基础上,溃疡再使用APG才能收到良好的效果。另外,在制备PRP时,无论使用何种分离方法,最后得到的PRP中血小板含量应在1　000×109/L以上,这样才能保证足够浓度的生长因子;在使用APG治疗溃疡时,应外敷油纱,避免生理盐水纱布吸附;同时应密切观察APG治疗后肉芽组织的生长情况。

图17-3　左足背溃疡经APG治疗后的愈合过程
患者,男,86岁。左足背溃疡1个月余,经APG治疗71天后痊愈。A.入院时溃疡原貌,溃疡表面充填坏死组织和大量脓性分泌物,伴臭味。箭头所指为第5跖骨骨髓炎伴死骨,SAD评分为12。B.经局部清创、去除死骨9天后,溃疡创面相对清洁。C.入院18天,创面经常规处理,SAD评分为8,给予第1次APG治疗。D～L.经过局部APG治疗后溃疡愈合的过程,L示溃疡完全愈合(从C～L,每2张图片的时间间距为6天)