血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳

血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳_生物化学实验技术

实验项目五　血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳

学习目标

【知识目标】

（1）能够迅速而准确地陈述血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的操作要点。

（2）能用自己的语言描述血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理。

【能力目标】

（1）能够准确描述电泳法分离的血清脂蛋白成分。

（2）能够通过血清脂蛋白电泳结果鉴别高脂蛋白血症的分型。

（3）能够鉴定血清脂蛋白电泳结果的异常状态，并能说明其临床意义。

（4）能够熟练使用离心机、恒温水浴箱。

案例引导

患者，男，50岁，在体格检查时血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳结果显示：α－脂蛋白含量正常，β－脂蛋白含量明显增高，前β－脂蛋白含量增高，无乳糜微粒。请初步诊断其患有何种病？且属于该病的哪种类型？

（提示：Ⅱb型高脂蛋白血症）

【实验原理】

血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳采用的支持介质是琼脂糖。琼脂糖是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料，分离去除琼脂胶成分而得到的一种多糖，由D－半乳糖和3，6脱水L－半乳糖的残基交替排列组成，再加水制成具有多孔网状结构的凝胶。琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐、分辨率高。同时，琼脂糖因不含带电荷的硫酸根和羧基，故几乎无电渗作用，对蛋白质吸附极微且几乎无拖尾，另外，还具有均一性好、牢固、富有弹性、透明、容易固定和干燥的特点，可制成清晰的膜，不吸收紫外线，便于扫描保存。琼脂糖是一种良好的电泳材料，分离效果较好，适用于蛋白质或核酸等大分子的分离、纯化、检测等，为临床不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等检测提供生化指标，也常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测。

血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白形式。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小相差也很大。根据Stoke定律，假定带电粒子为球形，带电粒子在电场中的电泳速度可用下列公式表示：

血清脂蛋白在同一pH值溶液中，可解离成带有不同电荷的离子，这些离子因电荷量、颗粒大小等差异，故在琼脂糖凝胶支持物上，以不同的电泳速度聚集在不同的位置，并可使各种脂蛋白颗粒分离开来，从而呈现出不同的电泳区带。将血清脂蛋白先用脂类染料（如苏丹黑）进行预染，再将预染过的血清用滤纸插条法（或其他方法）置于琼脂糖凝胶板上进行分离。本实验电泳系统采用的是pH值为8.6的巴比妥缓冲液，该溶液使得血清脂蛋白均带负电荷，通电后，脂蛋白向正极移动。电泳一段时间后，分离为三条区带，从正极到负极依次为α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些）、前β－脂蛋白（最浅）、β－脂蛋白（最深），在原点处为乳糜微粒。也可进一步定量分析，电泳后切下各脂蛋白区带，分别加热溶解，冷却后扫描测定各区带吸光度，计算出α－脂蛋白、β－脂蛋白和前β－脂蛋白的相对百分比。

【实验器材】

恒温水浴箱，电泳槽，电泳仪，加样器，载玻片，滤纸，离心机，离心管，分析天平，电炉或微波炉，锥形瓶，隔热手套，分光光度计。

【药品及试剂】

苏丹黑染色液，巴比妥缓冲液，凝胶缓冲液，琼脂糖，蒸馏水，血清。

【试剂配制】

1.苏丹黑染色液

称取0.1g苏丹黑B，溶于3mL无水乙醇中，使溶液饱和，或制成1%苏丹黑B石油醚－乙醇（1∶4，体积比）溶液。

2.巴比妥缓冲液

称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA 0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至10mL（pH值为8.6，离子强度为0.075）即为电泳缓冲液。

3.凝胶缓冲液

取三羟甲基氨基甲烷1.212g、EDTA 0.29g及NaCl 5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000mL，pH值为8.6。

操作流程

【操作步骤】

1.血清预染

用加样器取血清0.2mL置于0.5mL离心管内，加苏丹黑染色液0.02mL，混合后置于37℃恒温水浴箱中30min，取出离心管，离心（2000r/min）5min，除去多余的染料颗粒，即得染色后血清。

2.琼脂糖凝胶板制备

用天平称取相应质量的琼脂糖，配制0.45%的琼脂糖凝胶液。于电炉上加热融化后稍加冷却，再均匀浇注在载玻片上，静置待其凝固。待琼脂糖凝胶凝固后，距一端2cm处，用宽约15mm的硬滤纸条（或宽铁片）垂直切入凝胶板，再立即取出，打一小槽（1cm×0.1cm），并用滤纸吸去孔槽内水分，注意勿将小槽挑破。为避免可能出现载玻片与凝胶分离影响电泳效果的情况，可用滴管滴加一滴凝胶溶液于小槽中再随即吸出。

3.加样

用加样器取经预染过的血清（15～20μL）注入凝胶板上的小槽内。

4.电泳

将加完样的凝胶板平放在电泳槽中，样品端放于阴极一端。将两块四层厚滤纸（或纱布）放入巴比妥缓冲液中浸湿，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端，敷于胶板两端各1cm左右处，滤纸的另一端“引桥”浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，接通电源，电压为120～130V，每片凝胶板电流为3～4mA。经电泳35～50min，待观察到染色条带出现，停止电泳。

5.保存

如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。若无干胶机，可用玻璃纸包好凝胶板（连同载玻片），其上平铺多层吸水滤纸，滤纸上再压上书等重物，以吸干凝胶中的水分。也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2h，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但应随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度，以避免凝胶在脱水过程中龟裂。

【实验数据处理及结果分析】

绘出脂蛋白电泳图谱，自阴极端起，原点为乳糜微粒（CM），依次为β－脂蛋白（β）、前β－脂蛋白（前β）、α－脂蛋白（α），正常可出现三条区带。判断结果的方法如下。

1.直观观察

可用肉眼直接观察，以各区带颜色深浅、宽窄加以描述。血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳结果如图3－7所示。

图3－7　血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳结果示意图

2.定量分析

（1）切割分光光度法：将凝胶板上的各脂蛋白区带分别用刀片切下来，置于盛有3 mL蒸馏水的试管中，另在空白区切下一块与脂蛋白区带大小相当的空白凝胶作为空白样，置于另一支试管中。各管置于沸水浴中3min，使琼脂糖凝胶溶解。待冷却后，以空白管调零，于波长660nm处比色，记录各管吸光度值。以各自区带的吸光度值与α－脂蛋白、前β－脂蛋白和β－脂蛋白三条区带吸光度值总和之比求其相对百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。

A_x表示各部分脂蛋白x（如α、β、前β）的吸光度。

血清脂蛋白组分的相对百分比计算公式为：

（2）扫描定量：预染血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪中扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该患者的血脂总量，即可算出α－脂蛋白、前β－脂蛋白和β－脂蛋白的各自含量。

【注意事项】

（1）标本应为新鲜的空腹时的血清样本。

（2）当气温较高时，可将载玻片放在平稳的小冰块上以加速琼脂糖凝胶的形成；而当气温很低时，琼脂糖完全热熔后，应趁热迅速、均匀地涂在载玻片上。

（3）血清样品和染液的比例以9∶1左右为好，染液过多不仅会稀释标本，而且染液中的乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。

（4）琼脂糖凝胶的浓度为0.4%～0.5%，如果浓度大于1%，β－脂蛋白和前β－脂蛋白不易分开；如果浓度过低，则凝胶的机械强度太低，不易操作。

（5）制板时，载玻片应水平放置，锥形瓶瓶口垂直于载玻片中央，让琼脂糖凝胶快速流出，自然铺满整个玻片，铺板的凝胶温度控制在50～60℃为宜。

（6）琼脂糖凝胶易坏，应将铺好的琼脂糖凝胶板放在不易碰撞的地方。

（7）加样时，血清不能溢于槽外。

（8）用滤纸搭盐桥时，样品端滤纸要小心轻放，不能碰到加样槽，以免样品被吸干或将小槽拉裂。

（9）应根据电泳情况确定电压、电流，一般α－脂蛋白条带距离原点2～3cm为宜。

（10）如果需要保存电泳标本，可将电泳后的凝胶板，置于清水中浸泡脱盐约2h，再置于80℃烘箱中烘干即可。

【实验意义】

1.正常参考值（相对百分比）

（1）α－脂蛋白：20%～40%。

（2）β－脂蛋白：50%～60%。

（3）前β－脂蛋白：13%～25%。

2.意义

血脂高于正常参考值的上限时即称为高脂血症，临床上常见的有高甘油三酯血症和高胆固醇血症。由于血脂以脂蛋白形式在血浆中运输，因此，高脂血症常伴随有高脂蛋白血症。人体体内血清脂蛋白成分比例的分析是诊断高脂蛋白血症的重要依据。1970年世界卫生组织（WHO）建议，将高脂蛋白血症分为六型，即Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅲ型、Ⅳ型及Ⅴ型（表3－6）。其中，Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅳ型高脂蛋白血症是最常见的高脂血症。脂蛋白电泳对各型高脂蛋白血症等疾病的诊断具有重要的参考价值。

表3－6　血清脂蛋白电泳检测与高脂蛋白血症分型

本方法比较简便，重复性好，但乳糜微粒不够清楚。样品槽质量好坏对脂蛋白图谱有直接影响，因此要求样品槽大小要适宜，边缘要整齐、光滑。

（1）如果原点出现乳糜微粒、β－脂蛋白、前β－脂蛋白均正常或降低，结合血清甘油三酯明显升高，可定为Ⅰ型高脂蛋白血症。

（2）如果前β－脂蛋白比α－脂蛋白深，结合血清甘油三酯明显升高和胆固醇正常或略高，可以定为Ⅳ型高脂蛋白血症。

（3）如果β－脂蛋白区带比正常血清明显深染者，同时结合血清总胆固醇明显增高、甘油三酯正常者为Ⅱa型高脂蛋白血症；若结合血清总胆固醇增高而甘油三酯略高的前β－脂蛋白略溶者为Ⅱb型高脂蛋白血症。

（4）如果β－脂蛋白和前β－脂蛋白两区带分离不开而连在一起称为“宽β区带”，结合血清甘油三酯和胆固醇均有所增高，可定为Ⅲ型高脂蛋白血症。

能力检测

一、单项选择题

1.目前常用于脂蛋白电泳的技术为（　　）。

A.醋酸纤维素薄膜电泳　　B.转移电泳

C.琼脂糖凝胶电泳　　　　D.等电聚焦电泳

E.以上皆不是

2.1970年以后世界卫生组织将高脂蛋白血症分为（　　）型。

A.2　　B.5　　C.6　　D.7　　E.12

3.正常人空腹血清脂蛋白电泳定量α－脂蛋白正常参考值（相对百分比）为（　　）。

A.20%～40%　　　B.10%～20%　　　C.30%～40%

D.50%～60%　　　E.13%～25%

4.血清脂蛋白电泳与血清蛋白电泳最大的不同在于（　　）。

A.所用的电泳槽不同　　B.电泳支持介质不同　　　C.电泳电流不同

D.电泳缓冲液不同　　　E.所用的染料不同

5.正常人空腹12h后抽血做血清脂蛋白电泳，从负极到正极依次会出现哪几条电泳谱带？（　　）

A.β－LP、前β－LP、α－LP　B.前β－LP、β－LP、α－LP

C.α－LP、前β－LP、β－LP　D.α－LP、β－LP、前β－LP

E.α－LA、β－LP、前β－LP