琼脂糖凝胶电泳检测产物

实验二　琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

一、实验目的

1.了解琼脂糖凝胶电泳技术分离DNA的基本原理。

2.掌握利用电泳技术分离PCR产物。

3.掌握如何利用凝胶成像仪观察、记录并分析电泳结果。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。DNA分子在碱性环境中（pH 8.3）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。DNA片段由于不同大小、不同形状和不同构象，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，借此可分析实验结果。

影响DNA片段琼脂糖凝胶电泳的几个因素如下。

（1）DNA分子的大小　线性DNA分子的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算未知DNA片段的大小。

（2）琼脂糖浓度　一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶（表3-1）。

表3-1　琼脂糖凝胶浓度与可分辨的线性DNA片断大小之间的关系

续　表

（3）DNA分子的形态　在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。

（4）电流强度　每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。

本实验中用GoldViewTM新型核酸染料代替溴化乙锭（EB），采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView^TM与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。GoldViewTM不仅能染DNA，也可用于RNA染色。

三、器材和试剂

电子天平、电泳仪、水平电泳槽、制胶槽、加样梳、凝胶成像仪、移液器吸嘴、微量移液器、锥形瓶、微波炉。

琼脂糖（Spanish，鼎国公司）、1×TAE电泳缓冲液、GoldViewTM核酸染料（赛百盛公司）、6×DNA上样缓冲液、DL2000DNA Marker、PCR产物。

四、操作步骤

1.制胶

（1）用电子天平称取1g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入100mL 1×TAE电泳缓冲液，即配制成浓度为1%的琼脂糖，稍微摇动后放入微波炉中用中火加热。

（2）1min后停止微波炉，戴手套抓住瓶子，摇转瓶子及其内容物，混合均匀后加热得更快更平稳。

（3）把瓶子放回微波炉中再加热，待液体沸腾后停止，摇匀。

（4）用耐热手套取出锥形瓶，观察琼脂糖是否完全熔化，若未完全熔化，重新放回微波炉中加热直至琼脂糖完全熔解为止。

（5）待琼脂糖冷却至60℃左右（不烫手）时，加入5μL GoldViewTM核酸染料（5μL/100mL TAE缓冲液），混匀，倒入插好加样梳的制胶槽中。

（6）水平放置，等待琼脂糖凝固。

2.上样

（1）竖直向上取出加样梳，注意不要破坏加样孔。将琼脂糖凝胶放入盛有1×TAE电泳缓冲液的水平电泳槽，加样孔一侧靠近电泳槽负极，电泳缓冲液没过凝胶1～2mm为宜。

（2）样品制备:取5μL PCR产物，加1μL 6×DNA上样缓冲液，混匀后加入点样孔，每个泳道加入一个样品，最后加入5μL DL2000DNA Marker。

3.电泳

盖好盖子，打开电泳仪电源，调至稳压，将电压设置为120V，开始电泳。通常等到溴酚蓝染料前沿到达凝胶的底部3/4处时停止电泳。

4.观察、记录并分析结果

（1）取出凝胶，尽量把缓冲液空干，放入凝胶成像仪观察。打开软件，先在0.5×窗口下用白光调节凝胶至合适的位置，然后调节至1×窗口，调节好焦距至清晰后，关闭白光，打开紫外光，调节亮度，点击拍摄按钮，将凝胶照片拍摄下来，关闭紫外灯，点击保存按钮，将图像存到电脑里。

（2）根据DNA Marker每条DNA条带的相对分子质量，对照并估算分析PCR产物的相对分子质量大小。

五、注意事项

1.琼脂糖凝胶浓度根据所要分离DNA片段的大小而定。

2.凝胶的厚度和加样梳的类型根据电泳需要而选择。

3.本实验中用GoldViewTM替代EB（溴化乙锭）染料。虽然未发现GoldViewTM有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套，并且尽量减少污染。

4.加入GoldView^TM的琼脂糖凝胶反复熔化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

六、实验结果与分析

1.PCR电泳图片（参考图3-2）

图3-2　PCR产物电泳图

2.GFP相对分子质量估算

七、参考文献

［1］　〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版.马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.

［2］　〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.

［3］　吴乃虎，等.基因工程原理.2版.北京:科学出版社，1998.

［4］　彭秀玲，等.基因工程实验技术.2版.长沙:湖南科学技术出版社，1997.