【实验原理】 DNA 分子有线状的，也有一些非线状的，如复制叉和重组DNA结构。双向琼脂糖凝胶电泳技术就是被人们开发用于研究一些非线状DNA 分子的技术。双向琼脂糖凝胶电泳技术（2-D gel）实际上可分为两类：中性/中性双向凝胶电泳和中性/碱性双向凝胶电泳技术。它们的工作原理如下。
1．中性/中性双向凝胶电泳 非线状的DNA 分子在琼脂糖凝胶中的泳动行为和线状DNA 分子相比是不规则的，并且这种行为随着琼脂糖浓度或电压增加而加剧。而这正是中性/中性双向凝胶电泳的工作原理：在第一向中，样品在琼脂糖凝胶中以低琼脂糖浓度、低电压的条件进行电泳，DNA 分子主要根据其分子量大小被分离。在第二向中，则采用高浓度琼脂糖凝胶和较高电压条件，DNA 分子的分离主要根据其形状。
2．中性/碱性双向凝胶电泳 此方法适合用来分析DNA 复制中间体。这些中间体包括各种长度的新链部分。在第一向中与中性/中性双向凝胶电泳一样采用中性pH，将DNA分子按其分子量大小分开。在第二向中，采用碱性pH，使DNA 复制中间体中新链部分释放，并按其长度分离，如同在普通琼脂糖凝胶中一样。双向凝胶电泳在分析DNA 结构方面，最大的特点就是简便易行。它已成功地应用于酵母DNA 复制起点的定位、确定酵母复制叉阻抑点以及DNA 复制抑制剂机制等研究。本书所介绍的实验步骤适用于分析3～5kb的复制型的DNA 限制性片段。
【材料】
1．琼脂糖粉。
2．TBE 储存液（450mmol/L Tris-硼酸盐，10mmol/L EDTA），1L。
Tris 碱 54g
硼酸 27.5g
0.5mmol/L EDTA 20ml
溶于水中，室温保存。
3． 6×加样缓冲液：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯菁，15% Ficoll溶于水中，室温保存。
4．碱性缓冲液（40mmol/L NaOH 和1mmol/L EDTA），1L。
5mol/L NaOH 8ml
0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 2ml （需新鲜配制）
5．EB 储存液（10mg/ml）：1g EB，100ml 去离子水，避光容器4℃保存。
【操作步骤】
1．中性/中性双向凝胶电泳
（1）第一向电泳（低琼脂糖浓度和低电压）
2．中性/碱双向电泳
（1）第一向电泳：中性/碱性双向电泳的第一向同中性/中性双向电泳的第一向电泳步骤几乎完全相同。
（2）第二向电泳（0.8%琼脂糖，NaOH-EDTA 缓冲液，电压1V/cm）。
【注意事项】
1．DNA 片段的大小对双向电泳条件的选择是一个关键因素，本实验所用例子为3～5kb。如果DNA 片段超过5kb，双向电泳的条件需要相应地改变。
2．加样量也是一个关键步骤，理想的加样量是300～1 000ng。
3．第一向电泳中，凝胶的长度应至少达到25cm，才能保证更好地分离。0.4%的琼脂糖凝胶比较脆，取梳子时要格外小心。
4．TBE 浓度最初采用90mmol/L Tris-硼酸盐和2mmol/L EDTA。但现在通常所用的浓度仅为其一半即可提供所需缓冲能力。
5．在整个中性/中性双向电泳过程中，要使用同一批TBE 储存液，以保证相同的离子强度和pH。
6．在双向电泳过程中，可在样品一端加合适的DNA 分子量标记物，帮助分析样品的大小和位置。在第一、第二向中，该标记物都起重要作用，尤其在第二向中作用更大。
（余海浪）
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