琼脂糖凝胶电泳检测

实验一　琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【实验目的】

1．掌握琼脂糖凝胶电泳DNA的原理。

2．学习琼脂糖凝胶电泳DNA的方法与步骤。

3．掌握紫外电泳图谱的观察分析方法。

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳是DNA研究中常用的技术，可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。琼脂糖凝胶电泳也是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。带电荷的物质在电场中的定向运动称为电泳，核酸分子是两性解离分子，在pH8．0时，DNA分子带负电荷在电场中向正极移动。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，而且也可以分离分子量相同但构型不同的DNA分子。影响DNA分子泳动速率的因素很多，如分子量大小、分子构型、凝胶浓度、电场强度、EB含量、电泳缓冲液等。线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。DNA分子量越大，其电场泳动速率越慢。同一种质粒的三种构型泳动速率不同:超螺旋闭合环状质粒泳动速率最快，线型质粒其次，开环型质粒最慢。一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。

表6-1　　　　　　　琼脂糖浓度与可分辨的线性DNA片段大小之间的关系

凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，借此可分析实验结果。

【实验器材】

电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽、凝胶成像系统、高速离心机等。

【药品试剂】

1．琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、溴化乙锭(EB)、DNAMarker(λDNA酶切片段)、称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒(100 ml)、Tip头(10μl)、胶带等。

2．5×TBE电泳缓冲液(pH8．0):称取Tris 54 g、硼酸27．5 g，再加入20 ml的0．5 mol/L EDTA(pH8．0)，加蒸馏水定容至1000 ml。

3．6×凝胶加样缓冲液:称取溴酚蓝0．25 g和蔗糖40 g，然后加入蒸馏水定容至100 ml，摇匀后，4℃保存备用。

【实验方法】

1．制胶:

(1)称取0．4 g琼脂糖置于三角瓶中，加入50 ml 0．5×TBE缓冲液。

(2)微波炉加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2～3次，使琼脂糖充分融化。

(3)胶带将胶床两端粘好，底部粘严，以防凝胶渗漏，插好梳子。

(4)待胶冷却至70℃左右时，再加入溴化乙锭(10 mg/ml)5μl，摇匀。立即将琼脂糖溶液小心地倒入胶床中，让胶自然冷却至完全凝固(需要20～30分钟)。

(5)小心向上方拔出梳子，避免前后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔，去掉制胶槽两边的胶带，小心将胶和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。

(6)向电泳槽中加入0．5×TBE电泳缓冲液，液面高于胶面约1～2 mm。

2．上样电泳:

(1)取2μl上样液(溴酚蓝指示剂)于Parafilm上，加2μl水与2μl样品DNA反复吹吸，混匀。

(2)同时上样λDNA/HindⅢ作为DNA分子量标准(23．7 kb; 9．46 kb;6．75 kb;4．26 kb;2．26 kb;1．98 kb;0．58 kb)。

(3)Tip头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于胶孔中。

(4)接通电源，打开高压开关，按照5V/cm调节电压值，电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准。

(5)根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。

3．凝胶紫外观察:取出染色后的凝胶，于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察、照相、保存、记录结果。

【注意事项】

1．制胶和加样过程中要防止气泡的产生。

2．EB具有强诱变性，可致癌，必须戴手套操作，严格注意防护。

3．加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。

4．电源接通时，应核实电泳的方向是否正确。

5．每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。

【思考题】

1．琼脂糖凝胶电泳能否作为DNA简单定量检测的一个方法?如果是，请解释原理。

2．琼脂糖凝胶电泳如何测定DNA的相对分子质量?