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的变性琼脂糖凝胶电泳

时间:2022-10-19 百科知识 版权反馈
【摘要】:RNA可以使用非变性或变性琼脂糖凝胶电泳进行检测。判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。4.25ml 1%变性琼脂糖凝胶:10×电泳缓冲液2.5 ml,琼脂糖0.5 g,0.1%DEPC水18.3 ml,加热溶解,稍冷却,加入4.25 ml 37%甲醛。3.加样:将凝固后的甲醛琼脂糖凝胶从制胶槽转移至电泳槽,加入电泳缓冲液待上样。
的变性琼脂糖凝胶电泳_生物化学实验指导

实验二 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】

学习和掌握RNA的变性琼脂糖凝胶电泳的技术。

【实验原理】

RNA可以使用非变性或变性琼脂糖凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,虽然可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,但是无法确定分子量,主要是RNA分子存在二、三级结构而影响其电泳结果。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛或戊二醛。

判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰地看到18S rRNA(或者16S rRNA)、28S rRNA、5S rRNA的三条带,且28S rRNA的亮度应为18S rRNA(或者16S rRNA)的两倍。

【实验器材】

电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽、凝胶成像系统等。

【药品试剂

1.实验材料:总RNA提取物。

2.0.1%DEPC水:200ml双蒸去离子水加0.2 ml DEPC焦炭酸二乙酯混匀,室温放置过夜,高压灭菌。

3.10×电泳缓冲液:0.4 mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)(pH 7.0),0.1 mol/L NaAc,10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。

4.25ml 1%变性琼脂糖凝胶:10×电泳缓冲液2.5 ml,琼脂糖0.5 g,0.1%DEPC水18.3 ml,加热溶解,稍冷却,加入4.25 ml 37%甲醛。

5.上样缓冲液:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。

6.去离子甲酰胺。

【实验步骤】

1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。

2.制胶:称取0.25 g琼脂糖,加入放有18.3 ml的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入2.5 ml的10电泳缓冲液、4.25 ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。

3.加样:将凝固后的甲醛琼脂糖凝胶从制胶槽转移至电泳槽,加入电泳缓冲液(1)待上样。在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10)2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺10μl、RNA样品3.5μl。混匀,置60℃保温10分钟,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。

4.电泳:连接电源线,打开电泳仪,稳压5 V/cm电泳。

5.观察电泳结果:当指示剂电泳至胶中部即可结束电泳,通过紫外分析仪,对电泳胶进行观察和照相,记录实验结果。

6.分析电泳结果:记录所观察的电泳图谱,注意每条带的相对位置及浓淡情况等。在正常情况下,紫外灯下可见28S、18S(或16S)和5S rRNA三条带,观察28S和18S(或16S)二条带是否清晰,若28S的荧光强度为18S(或16S)的二倍以上,则说明RNA分子没有降解。×××

【注意事项】

1.实验中必须防止RNase污染以免RNA降解。

2.所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并蒸汽灭菌。

【思考题】

1.如何判断总RNA提取物的质量?

2.实验中怎样避免RNase污染?

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