聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

实验项目十六　聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作要点。

（3）能够准确鉴别聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成聚丙烯酰胺凝胶电泳的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够清楚聚丙烯酰胺凝胶电泳操作有哪些注意事项。

（3）能够正确分析聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

案例引导

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是细胞核中一种典型的非组蛋白，研究发现HMGB1可以释放到细胞外介导炎症反应，因此在临床血清标本中检测HMGB1的含量，可以作为一些炎症相关疾病的辅助诊断。血清中含有诸多蛋白，请运用所学知识思考使用何种方法可以对HMGB1进行分离。

【实验原理】

聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要依据是各蛋白质中各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及相对分子质量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基磺酸钠（SDS）时，电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的相对分子质量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的相对分子质量。

【实验器材】

电泳仪，垂直板电泳槽，进样器，乳头吸管，50mL小烧杯。

【药品及试剂】

标准蛋白质，丙烯酰胺，SDS，过硫酸铵，染色液，脱色液，TEMED（四甲基乙二胺）。

【试剂配制】

（1）标准蛋白质：细胞色素C、胰凝乳蛋白酶。

（2）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100 mL，置于棕色瓶中，于4℃条件下保存。

（3）1.5mol/L Tris－HCl分离胶缓冲液，pH＝8.8（4×）：取18.15g Tris，用1 mol/L HCl调pH值至8.8，加水至100mL，4℃条件下保存。

（4）0.5mol/L Tris－HCl浓缩胶缓冲液，pH＝6.8（4×）：取5.98g Tris，用1 mol/L HCl调pH值至6.8，加水至100mL，4℃条件下保存。

（5）电极缓冲液（pH＝8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02g Tris，加100mL 10% SDS，加水至1L，4℃条件下保存。

（6）10%SDS：取10g SDS，加水至100mL，完全溶解后室温下保存。

（7）10%过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配。

（8）染色液（0.25%考马斯亮蓝R－250、50%甲醇、7%乙酸）：取考马斯亮蓝R－250 2.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500mL、冰乙酸70mL，溶解后补足水至总体积为1000mL。

（9）脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）300mL，冰乙酸70 mL，补足水至1000mL。

（10）样品缓冲液（2×）：H₂O 2.4mL，浓缩胶缓冲液1.0mL、甘油0.8mL、10% SDS 3.2mL，2－硫基乙醇0.4mL，0.025%（W/V）溴酚兰0.2mL。

（11）TEMED（四甲基乙二胺）。

操作流程

【操作步骤】

（1）制胶模具的安装：制胶模具如图3－8所示。

图3－8　制胶模具

（2）根据所测蛋白质相对分子质量的范围，选择某一合适的分离胶浓度。按表3－27所列的试剂用量配制不同浓度的分离胶。将分离胶混匀后立即灌注于玻璃板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倒去正丁醇并用滤纸吸干。

表3－27　不同浓度分离胶的配制（单位：mL）

（3）浓缩胶的制备：按表3－28配制不同浓度的浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子，将凝胶垂直放于室温下聚合。

表3－28　不同浓度的浓缩胶的配制（单位：mL）

（4）样品预处理：取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃条件下加热1～2min。

（5）待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，然后将胶板固定于电泳装置上，上、下槽各加入电极缓冲液。

（6）加样：用微量进样器加样。每个样品孔加入20μL样品。

（7）电泳：在100～150V的电压下电泳，直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。

（8）染色：从电泳装置上卸下玻璃板，小心撬开玻璃板取出凝胶，放入染色液中染色2h以上。

（9）脱色：移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。

【实验数据处理及结果分析】

观察结果可见分离出许多蛋白质区带。以标准蛋白质的相对分子质量的对数与相对迁移率作图，得到标准曲线。再根据等测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。

【注意事项】

（1）丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应注意安全。

（2）灌注凝胶时注意保证凝胶的均匀，不要在其中留存气泡，否则影响电泳结果。

【实验意义】

SDS－PAGE电泳是生物化学中一项重要的实验技术，对于分离、检测蛋白质有很高的分辨率，现在广泛应用于蛋白质的分离检测中。

能力检测

一、单项选择题

1.下列关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的叙述错误的是（　　）。

A.是最早使用的电泳技术　　B.是区带电泳的一种

C.具有分子筛的作用　　　　D.凝胶上层加浓缩胶可提高分离效果

E.分离血清蛋白质可以得到20种以上的组分

2.血清蛋白电泳时通常用pH值为8.6的缓冲液，此时各种蛋白质带有的电荷为（　　）。

A.清蛋白带正电荷，其他蛋白带负电荷

B.清蛋白带负电荷，其他蛋白带正电荷

C.清蛋白和其他蛋白均带负电荷

D.清蛋白和其他蛋白均带正电荷

E.清蛋白和其他蛋白均不带电荷

3.下列关于电泳的支持介质，叙述错误的是（　　）。

A.对支持介质的基本要求是有化学惰性

B.支持物应有一定的坚韧度并适于保存

C.电渗作用越小越好

D.电渗方向与电泳方向一致时，则电泳速度加快

E.电渗方向与电泳方向相反时，则电泳速度加快