凝胶内的沉淀技术

一、凝胶内的沉淀技术

凝胶内沉淀技术是以适宜浓度的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体比例适合处出现肉眼可见的沉淀环或沉淀线。琼脂凝胶含水量在98％以上，形成凝胶网络，将水分固相化，因此可将凝胶视为一种固相化的液体。可溶性抗原和抗体分子在凝胶内扩散，犹如在液体中自由运动。但抗原与相应抗体结合后，形成的大分子复合物则被网络固定于凝胶内。盐水浸泡后能去除游离的抗原或抗体，将琼脂凝胶干燥后进行染色分析，可长期保存。根据试验时抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向免疫扩散技术、双向免疫扩散技术，以及与电泳技术结合的免疫电泳、对流免疫电泳和火箭电泳技术等。

（一）单向琼脂扩散技术

【原理】

在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂凝胶中的抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（g/L或U/mL）。

【试剂与器材】

（1）2％离子琼脂或生理盐水琼脂凝胶、标准马-抗人IgG血清（抗体）、工作标准参考蛋白、稀释的单人份待检血清标本，浓度为1∶50等。

（2）已制备好的含有1％马抗-人IgG抗体的琼脂凝胶板。

（3）PBS（pH7.2，0.01M）、打孔器、微量加样器、湿盒。

（4）37℃温箱。

【操作方法】

（1）标准曲线的制备

1）制备琼脂　按照玻片的大小，制作琼脂板所需要的1％琼脂凝胶。

2）稀释抗体　用pH7.2的PBS稀释标准抗-人IgG抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1∶140，原血清即应按1∶70稀释。分装试管，其分装量应与2％盐水琼脂量相等。

3）制备琼脂板　将已稀释的抗-人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持在56～60℃的2％盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1～2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），马上倾注于载玻片上，凝固后即成为琼脂凝胶板。

4）打孔　将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10 mm。

5）稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）　根据说明书进行稀释。

6）加样　将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10μL。

7）扩散　将加样的琼脂凝胶板放湿盒中，置37℃温箱24 h。

8）制作标准曲线　用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵坐标，以标准参考蛋白量（U/mL）为横坐标，在半对数坐标纸上绘制成标准曲线。

（2）人血清中IgG的测定

1）打孔　将已制备好的抗体琼脂凝胶板置打孔模板上，每一琼脂凝胶板可打孔4个（孔径3 mm，孔距10 mm）。

2）加样　将待测血清用PBS作1∶50稀释，用微量加样器取1∶50稀释的单人份血清标本10μL加入孔中，每份标本应各加两孔。

3）扩散　作好标记放于湿盒中，置37℃温箱，24 h后观察结果。

【结果判断】

测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的量（U/mL），并换算为单位是mg/mL的数值。

【注意事项】

（1）在制作标准曲线时，为减少误差，至少应做两份以上标准板。

（2）加样时，每吸取一份标本均应更换塑料吸头。

【临床应用】

本技术可用于检测正常人群或患者血清中的IgG、IgA及IgM的水平。

（二）双向琼脂扩散技术

【原理】

双向免疫扩散技术是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及两者之间的比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当存在多个抗原、抗体系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的浓度、特异性等。

【试剂与器材】

（1）1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4 mL、脐带血清、待测血清、AFP免疫血清。

（2）打孔器、载玻片、微量加样器、湿盒等。

（3）37℃温箱。

【操作方法】

（1）制备琼脂　将已溶化的1％盐水琼脂管放入58～60℃水浴箱中平衡温度备用。

（2）制备琼脂　板将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂4 mL，使之成为厚度约1.5 mm琼脂板。

（3）打孔　待琼脂凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，用打孔器在琼脂板上打孔，孔距6 mm，呈梅花形排列，即中间一个孔，周围六个孔，将孔内琼脂用注射器针头挑出。

（4）加样　用微量移液器取10μL AFP免疫血清准确加入中央孔内，上下孔各加10μL脐带血清作为阳性对照，其余孔加等量的待测血清。

（5）扩散　将加好样的琼脂板置水平湿盘内，于37℃温箱反应24 h。

【结果判断】

待测标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线吻合，则为阳性反应；如无沉淀线出现或出现与阳性对照沉淀线交叉的沉淀线则为阴性。

（1）融合性沉淀孤，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。

（2）两沉淀线独自形成并交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。

（3）融合性沉淀弧出现支线，说明两孔中抗原有相同成分又有不同成分，此为部分同一性反应。

【注意事项】

（1）倾注琼脂凝胶速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续，以保证琼脂板均匀、平滑。

（2）加样时，注意不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。

（3）反应时间要适宜。时间过长，沉淀线可解离造成假阴性；时间过短，则沉淀线不出现。

（4）抗体、阳性血清及待测标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。

【临床应用】

可用于抗原或抗体的定性、相对分子质量及其性质等的分析。