三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

钙调蛋白（CaM）最先在小鼠脑中被发现，其对环腺苷酸磷酸二酯酶具有催化作用（Means et al，1980）。此后相关研究表明钙调蛋白参与多种生命活动和生理反应过程，如细胞的分裂和代谢、细胞的运动、生殖发育等（Eldik et al，1989；Zuhlke et al，1999）。有学者也证实CaM调节果蝇（Drosophilamelanogaster）体内钙的储存，同时参与神经递质的合成与释放（Arnon et al，1997）。此外，对长牡蛎（Crassostrea gigas）、紫贻贝（Mytilus edulis）和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）CaM基因的克隆及功能研究中也表明，CaM在钙离子的获取和转运过程中起着非常重要的作用（Stommel et al，1982）。Chen 和Watson提出了Ca21信号正向调节蜕皮的观点，并且发现在一个自然的蜕皮周期里，Ca21水平的整体变化趋势与蜕皮激素浓度变化趋势相一致（Chen et al，2011）。Gao和White的研究表明，CaM在蜕皮周期的表达水平呈现波动，推测CaM在功能上与蜕皮相联系，但是相关的功能与调控作用有待于深入的研究（Gao et al，2009）。许多研究结果也表明，蜕皮过程中存在Ca21 的吸收与转运。鉴于钙调蛋白在Ca21 的调节上具有至关重要的作用，我们参考本实验室构建的三疣梭子蟹蜕皮相关基因的表达谱，选取三疣梭子蟹的CaM基因进行克隆，并进行序列与表达分析，进一步丰富CaM的研究资料，并尝试探讨其在蜕皮过程中的作用。

三疣梭子蟹钙调蛋白基因（PTCaM）cDNA全长1.9.1　bp，其中开放阅读框长450 bp，编码一条长149个氨基酸的蛋白（图9）。CaM序列非常保守，脊椎动物中CaM序列在氨基酸水平上完全一致（Yuasa et al，2001）。氨基酸序列比对分析显示，PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹的CaM氨基酸序列覆盖率高达100%，与凡纳滨对虾、克氏原螯虾和仿刺参覆盖率高达99%，说明在节肢动物门中，CaM的氨基酸序列的差别极其微小（图10）。进化上的保守性，也能说明钙调蛋白在功能上有着非同一般的重要作用。PTCaM二级结构的预测显示，α螺旋占63.09%（图11），三级结构预测显示，PTCaM具有钙离子配基（图12），说明其与钙离子的紧密相关性。PTCaM属于EFh超基因家族，具有4个EF-hand结构。EF-hand结构是Ca21 的结合区，每个EF-hand具有2个Ca21 结合域，各个Ca21 结合域可以结合1个Ca21 （Gomez et al，2000；Zheng et al，2000）。现今的研究也发现，EF-hand通常成对出现，并形成一个分离的区域。因此该家族的蛋白结构有2个、4个或6个EF-hand结构，成对的EF-hand结构之间可以相互作用，显示出正向协同效应（Gifford et al，2007）。该基因具有4个EF-hand，说明PTCaM基因属于EF家族，并证明了EF-hand成对出现的结论。

图9　PTCaM基因的核苷酸序列及推导的氨基酸

ATG：起始密码子；TGA：终止密码子；阴影（DDN-E/DDD-E）：Ca21 结合位点；下划线：EF-hand蛋白超家族保守结构域。

实时定量PCR结果显示，PTCaM基因在三疣梭子蟹眼柄、血细胞、肌肉、肝胰腺、心脏、鳃、卵巢中均有表达，在血细胞、肌肉、鳃和卵巢中的相对表达量较高（图13）。有研究证明CaM与许多重要的酶联合作用参与众多生化反应，如糖原的合成与分解、蛋白质磷酸化及脱磷酸化、细胞内的钙离子浓度的调节、平滑肌收缩、细胞分裂和核酸代谢等（Tang et al，2001；Kahl et al，2003；Taylor et al，2002；Sanhueza et al，2007；Zayzafoon et al，2006）。根据先前研究可推测：PTCaM基因在三疣梭子蟹的肌肉和肝胰腺中主要参与糖原的分解和能量的代谢，在鳃中主要参与钙离子的吸收与代谢，在卵巢中主要参与DNA的合成，在心脏中主要参与心肌肌质的反应，在眼柄中主要参与神经信号的转导。具体的精确调节机制以及其细胞定位还有待于更深入的研究。

图10　三疣梭子蟹CaM蛋白氨基酸序列与其他物种CaM蛋白氨基酸序列比对

箭头所指的为4个Ca21 结合位点（DDD-E/DDN-E）。

图11　PTCaM蛋白二级结构预测

注：蓝色：α螺旋；红色：延伸链；绿色：β转角；粉红：不规则卷曲

图12　PTCaM蛋白的三级结构预测

图13　PTCaM基因在三疣梭子蟹不同组织中的表达情况

在三疣梭子蟹不同蜕皮时期，各个组织中PTCaM基因实时定量对比，了解到该基因均出现差异表达（图14），充分说明了PTCaM基因参与到蜕皮调控中并在各个组织都具有调控作用。眼柄和鳃中的PTCaM基因差异表达最为显著，为蜕皮后期表达量明显降低。我们推测蜕皮间期和前期，蟹为蜕皮做准备，活化后的CaM影响的酶较多，参与的调控反应也较多，同时钙离子的吸收与重吸收作用也较多。心脏、血细胞和肌肉中的PTCaM基因在蜕皮前期表达量较高，我们推测在临近蜕皮期间，离子的转运强度加大，能量代谢加大。肝胰腺中的PTCaM表达结果经SPSS软件分析结果为差异不显著。三疣梭子蟹的肝胰腺具有吸收和储存营养、分泌消化酶等，在蜕皮时期肝胰腺可将储存的脂质转移到其他组织，保证能量供给（Jiang et al，2009；Wen et al，2001；Vogt et al，1994；姚桂桂等，2008）。因此我们推测肝胰腺中，该基因一直处于相对稳定且较为活跃的表达状态。PTCaM在蜕皮时期各个组织中的整体表达趋势为：在蜕皮前期表达量上升，在蜕皮后期表达量下降。这与Ca21 在蜕皮时期的变化趋势相一致（Chen et al，2012），说明了钙调蛋白在三疣梭子蟹蜕皮周期中对Ca21 的调节具有十分重要的作用。

图14　各个组织中PTCaM基因在三疣梭子蟹不同蜕皮时期的相对表达情况

图15　蜕皮间期，PTCaM基因在去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中的相对表达情况

图16　蜕皮前期，PTCaM基因在去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中的相对表达情况

图17　蜕皮后期，PTCaM基因在去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中的相对表达情况

研究不同蜕皮时期去除单侧眼柄的三疣梭子蟹与正常三疣梭子蟹各个组织中PTCaM的表达情况，结果显示：去除单侧眼柄后，PTCaM在蜕皮间期和前期相对于正常情况表达下调（图15、图16）。由于蜕皮激素对甲壳类的蜕皮过程起着至关重要的作用（姚俊杰等，2006；Qian et al，2014），而眼柄中的窦腺复合体分泌蜕皮抑制激素（MIH）和蜕皮激素（Ecdysone）存在着反馈抑制调节作用（宋霞等，2000；Nakatsuji et al，2009；Chung et al，2003），去除眼柄能够造成MIH分泌的降低和蜕皮激素分泌的增加（Uawisetwathana et al，2011）。因此我们推测，眼柄神经肽类激素分泌的降低或者蜕皮激素的上升将会影响PTCaM基因的表达，证明了三疣梭子蟹CaM基因在蜕皮过程中与MIH或者蜕皮激素具有一定的相互作用。而在蜕皮后期去眼柄与正常相比，PTCaM基因整体呈现上调趋势，推测是因为去除单侧眼柄的缘故，Ca21 的再利用与生物矿化过程更依赖于PTCaM的调控作用。