三疣梭子蟹钙网蛋白

钙网蛋白（calreticulin，CRT）是内质网和肌浆网中高度保守的、多功能的Ca21 结合蛋白，它广泛分布在几乎所有的多细胞真核生物中。1989年Ostwald等首次在兔的骨骼肌肌浆网中分离得到钙网蛋白（Ostwald T J et al，1989），随后Filege等第一次从鼠的肝脏细胞cDNA文库中克隆得到钙网蛋白基因（Fliegel L et al，1989；Smith M J et al，1989）。CRT功能复杂多样，参与到细胞内Ca21 稳态调节、Ca21 依赖的信号传导、细胞凋亡、蛋白加工、抗原呈递、黏附和类固醇敏感性基因表达调节等生物学进程中。CRT基因是一个高度保守的序列，由N、P和C三个区域的氨基酸序列组成。研究表明，CRT参与鱼虾应对Ca21 胁迫、病毒感染、热激、饥饿胁迫、氧化胁迫和重金属污染等反应。Braman等研究发现罗氏沼虾（M. rosenbergii）在盐度胁迫下CRT基因上调表达（Barman H K et al，2012），这表明CRT基因在盐度胁迫应答中也发挥了重要作用。目前，在鲈鱼（Dicentrarchus labrax）（Pinto R D et al，2013）、中国对虾（F. chinensis）（Luana W et al，2007）、长牡蛎（crassostrea gigas）（Kawabe S et al，2010）和菜青虫（pieris rapae）（Wang L et al，2012）中已经克隆得到CRT基因全长。然而，三疣梭子蟹CRT基因序列及其在盐度胁迫中的应答机制相关研究尚未见报道。

本研究采用RACE技术首次克隆得到三疣梭子蟹钙网蛋白PtCRT基因序列，全长1.6.6　bp，包含1.2.8　bp的开放阅读框，编码1个由405个氨基酸组成的多肽（图48）。PtCRT基因中存在两个保守的钙网蛋白家族标签：KHEQNIDCGGGYLKVF和LMFGPDICG，说明PtCRT基因为钙网蛋白家族成员。序列分析发现，PtCRT翻译的氨基酸序列中包含一个由17个氨基酸组成的信号肽序列（MKIYILLALLGVALVEA）和一个内质网滞留四肽序列HDEL。同源性分析表明，三疣梭子蟹PtCRT与中国对虾（F. chinensis）CRT基因的同源性高达89%（图49）。系统进化分析表明，三疣梭子蟹PtCRT与同属于甲壳类动物的中国对虾（F. chinensis）、斑节对虾（P.monodon）、凡纳滨对虾（L. vannamei）、小龙虾（Pacifastacus leniusculus）紧密相聚（图50）。

图48　PtCRT基因cDNA全长及其编码的氨基酸序列

斜体字母表示起始密码子；星号表示终止密码子；虚线标出的是信号肽序列；方框内的是两个钙网蛋白家族保守序列；下划线表示钙网蛋白家族三个重复序列（位于206-218，223-235和240-252）；双下划线表示内质网滞留四肽序列HDEL；阴影表示多聚加尾信号AATAAA。

图49　PtCRT氨基酸序列与其他物种的CRT氨基酸序列比对

下划线表示两个保守的钙网蛋白家族标签；方框表示三个重复序列（位于206-218，223-235和240-252）；双下划线表示内质网滞留四肽序列H（K）DEL；上述物种的氨基酸序列的GeneBank登录号：中国对虾（ABC50166），斑节对虾（ADO00927），马氏珠母贝（ABR68546），人类（BAD96780），荷兰猪（XP_003468401），家兔（NP_001075704）。

不同字母表示组间差异显著（P , 0.05），相同字母表示组间差异不显著（P . 0.05）。

三疣梭子蟹PtCRT基因的表达具有组织特异性，实时荧光定量PCR结果显示，PtCRT基因在三疣梭子蟹鳃、肝胰腺、肌肉、眼柄、血细胞、心脏中均有表达（图51）。其中，在肝胰腺中的表达量最高，其次为眼柄和鳃，肌肉和心脏中的表达量较低，而血细胞中仅有微量表达。CRT的功能多样性是其组织分布多样性的一个重要原因，其功能涉及细胞免疫、Ca21 稳态调节、信号转导、基因表达调节、细胞粘附和蛋白质加工等多个方面。本研究结果显示三疣梭子蟹PtCRT在肝胰腺中的表达量最高，这与Kales 和Liu在虹鳟鱼（Kales S et al，2004）和斑点叉尾（Liu et al，2011）中的研究结果一致。肝脏是离子代谢和贮存的重要器官，胞内钙离子的调节在其中进行，因此PtCRT基因在三疣梭子蟹的肝胰腺中表达量相对较高。

图50　利用不同物种的氨基酸序列构建的系统进化树

分叉处数值表示1 000次重复抽样所得到的置信度；标尺长度代表每个位点发生0.1次置换。

图51　三疣梭子蟹不同组织中PtCRT基因的表达

图52　高盐胁迫下三疣梭子蟹鳃中PtCRT基因的表达情况

不同字母表示不同时间点之间差异显著（P , 0.05），相同字母表示不同时间点之间差异不显著

图53　低盐胁迫下三疣梭子蟹鳃中PtCRT基因的表达情况

不同字母表示不同时间点之间差异显著（P , 0.05），相同字母表示不同时间点之间差异不显著（P . 0.05）。

表3　在低盐度敏感和耐受个体中PtCRT基因SNP位点分布情况

续表

当P . 0.05时，SNP位点分布于低盐度耐受和敏感组关联不显著。

鳃是甲壳动物最重要的渗透压调节器官，也是甲壳动物与外界进行离子和气体交换的重要介质，因此本研究分析了盐度胁迫进程中PtCRT基因在鳃中的表达规律。本研究结果显示，高盐胁迫和低盐胁迫下，PtCRT在鳃组织中均呈上调表达趋势（图52、图53），这与Barman等（Barman H K et al，2012）在罗氏沼虾中的研究结果一致。盐度胁迫下，胞内游离钙离子浓度会增大，PtCRT基因上调表达以维持Ca21 稳态。

SNP标记在构建遗传连锁图谱、关联分析、种群进化、亲缘关系鉴定和疾病的诊断等生物学研究中发挥了重要作用。本研究在PtCRT基因上共找到6个SNP位点，所有突变均位于开放阅读框区域。关联分析表明，1.2.9　G/A位点与低盐耐受性显著相关（P , 0.05）且发生了非同义突变（表3）。