三疣梭子蟹选育家系微卫星分析

随着分子标记技术的发展，微卫星由于数量多、分布广、多态性丰富、易于检测、共显性遗传及鉴别纯合子、杂合子等优点，已经成为一种广泛应用的分子标记。目前为止，研究者们已经运用微卫星标记开展了不少海洋物种选育群体的工作，如大黄鱼（Pseudosciaena crocea）连续4代选育群体遗传多样性与遗传结构的微卫星分析（赵广泰等，2010），凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）4个选育群体遗传多样性的SSR分析（谢丽等，2009），吉富罗非鱼不同选育群体的遗传多样性（李莉好等，2007），鲤（Cyprinus carpio）易捕性状选育群体不同世代微卫星分析（池喜峰等，2010），罗非鱼4个选育群体遗传结构SSR分析（蒋家金等，2008），中华鳖（Mauremysmutica）黄河群体选育世代F1、F2及F3遗传变异微卫星分析（张志允等，2011），中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）人工选育群体的遗传多样性（李晓晖等，2010）。但是，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的研究工作只限于几个方面，如对三疣梭子蟹构建微卫星富集文库并对野生群体进行了遗传分析（李晓萍等，2010），将微卫星DNA标记用于三疣梭子蟹家系亲子关系的鉴定（刘磊等，2010），用微卫星标记对三疣梭子蟹遗传连锁图谱作了初步构建（罗云等，2010），有关三疣梭子蟹家系选育工作仍旧没有开展。本实验即以此为研究出发点，分析了4个不同世代家系的遗传结构，从分子水平了解三疣梭子蟹家系的遗传背景和遗传多样性，以期为良种选育提供基础。

本实验所用三疣梭子蟹共120只。其中，05-A2-1是实验室培育兄妹连续近交第四代家系，用F4表示；06-U-1为自交第三代家系，用F3表示；07-DZ4-1为自交第二代家系，用F2表示；08-LZ2-2为自交第一代家系，用F1表示，每个家系数量均为30只。样品运回实验室后，取大螯肌肉，置于灭菌的1.5mLEppendorf管中，编号，-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

微卫星PCR扩增所用引物如表15所示。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和1.5%硝酸银染色，根据产物的条带判断个体的基因型，数据处理用POPGENE和MEGA4软件进行。计算4个家系每个位点的多态信息含量（PIC）、等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ae）、多态位点杂合度（H）以及固定指数Fis、Fst值的F-分析等，并计算Nei氏群体间的遗传相似性系数I（Nei，1972）和遗传距离D（Nei，1978）。

表15　三疣梭子蟹16对微卫星引物序列

参照Botstein等的方法计算多态性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：

式中，Pi、Pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，n为等位基因数。

多态位点杂合度（观测值）：Ho为杂合子观察数与观察个体总数之比。

多态位点杂合度（期望值）：Hc512pi2，Pi为该位点上第i个等位基因的频率。

Fis5.1.2　Hc/Hg，P为某等位基因在群体中的平均频率；为该等位基因在群体之间的方差；平衡偏离指数d52Fis。

群体间遗传距离：DA52lnI。并用MEGA4软件的UPGMA法对三个群体进行聚类分析。