中国对虾选育群体的微卫星分析

中国对虾主要分布于我国黄海、渤海以及朝鲜半岛沿海，是我国北方重要的渔业对象及海水养殖虾类（邓景耀等，1990）。在1989到1992年养虾业发展的盛期，养殖规模达15.3.104　hm2，年产对虾20多万t（岑丰，1993）。但自从1993年虾病暴发以来，中国对虾的池塘养殖业严重受挫、一蹶不振，迄今未见恢复迹象。因此，培育优质高产抗逆的品种，是对虾养殖业迫切需要解决的问题。

自1997年起，黄海水产研究所开始人工选育计划（李健等，2000），进行了中国对虾人工选育工作。中国对虾人工选育群体是自山东日照市近海附近海域采捕的中国对虾，后代苗种放于对虾养殖池中，连续六年从染白斑点状综合征病（WSSV）存活的个体中选留大的个体作为亲虾进行选育。在选育过程中，与海捕个体较大的野生群体进行混养。至2002年已进行了六代选育，其生长速度快、发病率低。但是在人工选育过程中，经常发生不确定因素，如近交机率增加，有效群体数目减少等，有可能导致遗传多样性降低，从而降低遗传效应。因此，有必要对其遗传变异进行检测，了解其遗传结构的变化，以制订相应的科学措施从而保证育种工作顺利进行。

微卫星技术，亦称简单重复序列标记（Simple Sequence Repeats，SSR），作为一种新型的分子标记，其优点是技术简便、快速，稳定性好，检测获得的多态性位点多，遗传变异信息量大，并且遗传标记以孟德尔方式共显性遗传。SSR标记被广泛应用于生物学研究的各个领域。虽然已有其他技术如同工酶（王伟继等，2001；张子平等，1994）、线粒体DNA（邱高峰等，2000）、RAPD（石拓等，1999）技术应用到中国对虾的多态性研究，尚未有中国对虾人工选育群体微卫星分析的报道。张天时等（2005）利用SSR技术分析选育第1代（CP1）和第6代（CP6）的两个群体，跟踪其遗传变异的变化，分析选育过程对其遗传结构的影响。此外，从中国对虾人工选育群体的遗传分析中寻找与其性状相关分子标记并进行深入分析，可以为分子标记辅助育种奠定基础。

本研究对中国对虾人工选育的两个群体40个个体进行10个微卫星位点扩增，共产生74个等位基因。每个位点产生的等位基因数从3到13不等，产物片段大小为0.1～1.5 kb。

衡量一个分子遗传标记的多态性程度的大小与其在群体中能够检测出来类型的多少直接有关，类似于群体遗传多态性。衡量的标准有两个：一是杂合度，它实际上是在群体随机交配的情况下，一个个体的两个等位基因处于杂合状态的概率；另一个常用的指标是多态信息含量（PIC），它是在给定一个后代基因型时，能够判断一个亲本将其哪一个等位基因传递给后代的概率。一般多态性基因的定义是它最频繁出现的等位基因不超过0.95，这时相应的杂合度和多态信息含量不小于0.1，这也可以作为一个基因多态性的衡量标准（Ball et al，1998）。

图11　中国对虾在位点RS0622的SSR电泳图（a：CP6；b：CP1）

图12　中国对虾在位点RS0683的SSR电泳图（ a： CP6； b： CP1）

表23中国对虾两个群体10个微卫星位点的遗传多态性

表24　中国对虾在10个微卫星位点的F-分析及在两个群体间和群体内的遗传多样性分布

续表

从表23中的数据可以看出，在两个群体中，所观察到的等位基因数都比有效等位基因数多。PIC值从0.5.6　7.0.887　7。通过计算每个位点的等位基因数（na）、有效等位基因数（ae）、基因型数目（G）等的变化，来确定位点多态性变化规律。其中基因型数从4到18不等变化，例如在位点EN0033不同群体基因型数不同，两个群体分别为14（CP1），17（CP6）。两个群体的平均杂合度分别为0.6.0　0（CP1）和0.630.0（CP6）。

10个微卫星位点多态信息含量在0.556.7　～ 0.8.7　7之间，说明本实验所用分离群体群内遗传变异大，信息含量高，符合标记QTL连锁分析的基本设计要求，也符合对虾养殖的实际情况。每个位点所有等位基因数从3到13不等，比同工酶检测到的等位基因数多。杂合度（两个群体的平均杂合度分别为0.6.0　0.0.630　0）也比同工酶所报道的高。与同工酶等技术相比微卫星位点具有高度多态，共显性遗传等优点，因此SSR标记被广泛应用于生物学研究的各个领域。

从表24可知，Fst , 0.05表明两个群体遗传分化程度较弱。Fis , 0表明有5个观察杂合度过剩的现象，其中在位点RS1101和RS0859两个群体都发生了观察杂合度过剩的现象。但对整个群体而言，两个群体均表现为一定程度的杂合子缺失。

通过对10个微卫星位点所检测到的表型频率进行遗传多样性计算分析，结果表明，两个群体的Shannon多样性指数分别为1.6.3　0.1.738　2，整个选育群体（两个群体作为一个群体）的遗传多样性指数为1.7.4　2。从Hpop/Hsp比值来看，在位点RS1101 和RS0676分别检测出群体内的最大和最小遗传多样性（Hpop/Hsp分别为0.9.1　32和0.9.2　77），群体内遗传多样性均值为0.9.4　15；而群体间的遗传多样性均值为0.0.5　85，可见绝大部分的遗传变异是在群体内检测到的。此外，两个群体间加上偏差矫正后相似性系数（I）高达0.9.8　7，彼此的遗传距离（D）仅为0.0.4　8。

表25　中国对虾两个群体的Nei遗传距离及相似性系数

注：对角线以下为遗传距离，对角线以上为相似性系数

衡量一个分子遗传标记的多态性程度的大小与其在群体中能够检测出来类型的多少直接有关，类似于群体遗传多态性。衡量的标准有两个：一是杂合度，它实际上是在群体随机交配的情况下，一个个体的两个等位基因处于杂合状态的概率；另一个常用的指标是多态信息含量（PIC），它是在给定一个后代基因型时，能够判断一个亲本将其哪一个等位基因传递给后代的概率。一般多态性基因的定义是它最频繁出现的等位基因不超过0.95，这时相应的杂合度和多态信息含量不小于0.1，这也可以作为一个基因多态性的衡量标准（Ball et al，1998）。

杂合度，它实际上是在群体随机交配的情况下，一个个体的两个等位基因处于杂合状态的概率；在两个选育群体中，都有杂合度的缺失，暗示出无效等位基因的存在，并且我们把这种情况当作纯合子而不是杂合子。另外，在聚合酶链式反应中聚合酶连续重复拷贝模板中的某种核苷酸的现象即“口吃”现象（Nei et al，1978）引起的两个等位基因重叠，应为杂合基因型而被错误地作为纯合基因型的现象，是引起基因型对Hardy-Weinberg平衡偏离的另一个因素。基于无效等位基因的数据设定，我们还进行了基因型对Hardy-Weinberg平衡的偏离程度检验，发现在群体内杂合度过剩的微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡。因此，可能是无效等位基因在一些微卫星位点是出现的，而在这些位点被忽略了。Ball等（1998）发现无效等位基因是作为解释杂合度缺失现象不可缺少的因素之一。杂合度的缺失或过剩但未偏离Hardy-Weinberg平衡，可能是由于人工选育过程中，选择压力造成的结果，但家系混养也可能是出现这种现象的根本原因（Zhen et al，2001）。

十足目甲壳动物遗传变异性较低是其系统发生的一个基本特征（李思发，1988），Hedgecock等（1982）在总结了65种虾蟹类的平均杂合度后也得出相同的结论。根据本研究结果，中国对虾第六代选育群体的平均杂合度（0.6.0　0）比第一代养殖群体的平均杂合度（0.6.0　0）略低，本研究的结果与王伟继等（2001）的结果相似。较短的生活史造成的瓶颈效应及缺乏随机漂变被认为是甲壳类遗传变异较低的主要原因，而人为干涉如过度开发、大规模不安全的人工放流等都有可能对对虾的遗传多样性产生影响。本实验中，两群体间的遗传相似度为0.9.8　7，彼此间的遗传距离仅为0.0.4　8，这与两群体的遗传多样性分析中遗传多样性差异百分比（1.6.3　0.1.738　2）、群体内遗传多样性均值为0.9.4　15，而群体间的遗传多样性均值为0.0.5　85基本吻合，亦即有96.415%的遗传多样性是来自群体内，只有3.585%的遗传多样性来自群体间，这表明，绝大部分的遗传多样性是在群体内检测到的，体现出人工选育群体的遗传多样性没有显著降低。另外，根据Fit和Fst值对2个世代群体遗传分化程度进行了检验，结果表明2个世代群体遗传分化程度较低。它们都说明在选育过程中，近交及瓶颈效应发生的可能性不大，遗传结构的改变主要是由人工选择压力造成的。这首先与选育的世代比较短有关，另外，也与选育过程中采取的措施密不可分。在选育过程中，留取了足够数目的亲虾，每一代的亲虾数量在1 000尾以上；其次，在收集虾卵时分批次进行而不是集中采集，因为虾类是高生殖力的生物，这样可以避免由于产卵时间的不同步性而造成的实际有效亲本数量太少；同时，严格控制交尾，选留后代覆盖面广，这些措施都有助于保持有效亲本数量，是育种过程中避免近交衰退的有效手段。总之，结果均说明第六代群体还有较大的选育潜力，可以继续保持遗传效应，最终保证选种育种工作的成功。