-分析方法在中国对虾中的应用

近年来，国内学者已广泛采用微卫星、RAPD、AFLP等技术对中国对虾遗传多样性（何玉英等，2004；Liu et al，2006）、遗传连锁图谱（孙昭宁等，2006；Li et al，2006；李健等，2008）和遗传标记的筛选（刘萍等，2007；黄付友等，2008）等方面进行了研究，这些研究结果为中国对虾的标记辅助育种奠定了理论基础。随着对虾育种工作的进一步深入，对虾的功能基因组学研究成为众多科研工作者关心的研究热点，利用mRNA差异显示技术寻找与生长、抗病/抗逆相关的功能基因并进行分离与功能验证，对于从分子水平了解对虾生长发育和抗性的遗传基础具有重要的启示作用。

近年涌现了许多寻找差异表达基因的方法，如cDNA-AFLP、DDRT-PCR、SSH、SAGE、cDNA表达芯片等。其中cDNA-AFLP技术是基于AFLP技术基础上建立的RNA指纹分析方法（Bachem et al，1996），该技术结合了AFLP和RT-PCR的优点，具有灵敏性高、重复性好等特征，无需了解模板序列信息，能集中显示基因组表达序列的多态性差异，可对生物体转录本进行全面系统的分析，广泛用于基因差异表达、转录连锁作图和基因克隆等领域（Breyne et al，2003）。该技术首先在植物转录组学研究中得到广泛应用，利用该技术已经在植物中分离了抗病、抗虫、抗干旱等多个相关抗性基因（Bachem et al，2000，2001；Durrant et al，2000），近年人们正逐渐将其应用于动物转录组学的研究。Ekkapongpisit等（2007）采用cDNA-AFLP技术分析感染Ⅱ型登革热病毒的人肝细胞，获得差异表达的65条转录衍生片段（Transcript derived fragments，TDFs），发现27个相关基因；Cappelli等（2007）采用该技术从阿拉伯马中筛选获得49 条TDFs，通过RACE技术克隆得到4个cDNA，并分析了这些基因在逆境胁迫下的表达模式；杜玉珍等（2008）利用该技术筛选获得43个新生牛关节骨骺软骨无血管区高表达的TDFs。cDNA-AFLP技术在水产动物上的应用还较少，Amy等（2000）利用该技术从斑马鱼独眼畸形突变体中鉴定出两个差异表达基因Crestin和Calreticulin。迄今为止，国内外尚未见cDNA-AFLP技术在中国对虾上进行应用分析的报道。李吉涛等（2009）参照Bachem等（1996）和Marnik等（2007）的实验方法，对其各关键技术环节进行改进，建立了适用于中国对虾的cDNA-AFLP分析体系。首先提取中国对虾血细胞总RNA，总RNA经DNase处理后，反转录酶合成cDNA第一链后，用DNA polymerase I合成cDNA第二链，取5 μL cDNA双链在1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析，相对分子质量大小分布于（0.1～10）3103，大小分布均匀。双链cDNA经EcoR I/Mse I双酶切后，产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在100～750 bp有一均匀的弥散带，说明酶切完全，可用于预扩增反应。预扩增产物稀释30倍作为模板进行扩增获得电泳条带较稳定（图3）。本实验共采用5对引物组合扩增出256条条带，其中多态性条带为201条，多态性比率达76.0 %～83.3 %（表6），为后续的不同地理种群或品系的中国对虾cDNA-AFLP分析奠定了基础。

表6　不同引物对中国对虾AFLP选择性扩增的结果

图3　不同引物组合选择性扩增产物部分电泳图

cDNA-AFLP是转录组学研究中广泛应用的一种有效的技术手段，该技术应用于新的生物系统时，通常需要对各个步骤进行改进。首先高质量和完整的RNA是保证cDNA-AFLP技术成功应用的关键因素，只有获得高质量的RNA，才能确保在随后的cDNA合成和AFLP分析中，可以反映生物体转录组的信息。本研究中，RNA的提取严格按照Trizol说明书进行操作，杜绝外源RNase的污染；随后选用逆转录活性较高的M-MLV反转录酶进行cDNA的合成，保证可以获得更多、更长的cDNA，以便随后的反应顺利进行。

酶切和连接是AFLP技术成功的关键，酶切要彻底，连接要充分，酶切连接时最好在PCR仪上进行，这样可以保证精确的温度和较好的酶切效果。如果酶切不彻底，很容易出现假阳性或假阴性，使选择性扩增重复性差，酶切完全与否直接影响 AFLP 的指纹图谱的质量，本实验选用识别位点为六碱基的EcoR I和四碱基的Mse I的双酶切组合对合成的cDNA双链进行酶切，试验结果表明酶切片段大小在100～750 bp之间，cDNA片段比较丰富，因此酶切效果较好。为了保证酶切产物与接头充分连接，我们选择在18 ℃连接过夜。

预扩增产物的稀释倍数会对整体实验结果产生较大的影响，预扩增产物需稀释后进行选择性扩增，否则会因模板浓度过高而不能得到清晰的谱带。本实验表明，稀释10倍、20倍、30倍的预扩增产物作模板进行选扩，得到的谱带带型几乎没有差别。一般预扩增产物稀释30倍后即可满足需要，最好使用同一批次稀释的预扩增产物来进行选扩试验，以减少试验误差。

不同的引物浓度及配比均会对PCR反应的结果产生影响，从实验结果看，12 μL选择性扩增反应体系中1﹕1摩尔比的EcoR I/Mse I选择性引物浓度配比是合适的，这与单独的AFLP分析中选择性引物配比为1﹕6或1﹕8的结果不太一致（季士治等，2007；李法君等，2008），分析原因可能是与不同物种间双酶切产生的片断不尽相同或模板的类型有关。AFLP选择性扩增时引物选择性碱基数目的多少直接影响着扩增条带的数目，本研究采用3个选择性碱基，扩增条带数为47～58，多态性条带比例较高，这与中国对虾AFLP反应体系所用的选择性碱基数目相一致（李朝霞等，2006）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染过程中，首先要注意PAGE胶的制备，要避免出现气泡，否则会影响局部的电压，引起条带变形，不利于结果的观察；此外，点样之前，应先进行预电泳使凝胶的温度升至50 ℃左右。银染时，我们发现采用Na2CO3配制的显色液进行显影经常会造成背景颜色太深，影响条带的观察，而换用NaOH配制显色液则可以获得背景清晰、显色均匀的凝胶图像。

不同生物的cDNA-AFLP反应体系是不同的。本研究对中国对虾的cDNA-AFLP反应体系进行了优化与改进，选用5对EcoR I1 3/Mse I1 3引物组合对中国对虾个体进行了分析，共得到256个位点，其中多态位点为201个，多态位点比率达76.0 %～83.3 %。扩增图谱条带清晰，无背景干扰，实验结果稳定可靠、重复性较高。该分析体系的建立，为进一步研究中国对虾生长发育和抗病 / 抗逆的分子机制提供了新的技术手段和途径，也为该技术应用于其他甲壳类动物基因的差异表达研究奠定了基础。