构建遗传连锁图谱需要大量的分子标记，微卫星标记具有多态性好，分布广泛，遗传连锁不平衡等特点，是遗传作图的首选标记。三疣梭子蟹SSR标记已有报道，但是可用于作图的数量较少。AFLP技术是基于PCR技术的限制性片段DNA指纹技术，可在未知基因组信息的情况下得到大量多态性片段。罗云等（2010）利用171个AFLP标记构建了第一个三疣梭子蟹遗传连锁图谱。本研究以三疣梭子蟹F2代110个个体为作图材料，利用55个微卫星标记和1239个AFLP标记构建了三疣梭子蟹中密度遗传连锁图谱，相对于罗云等（2010）结果，本结果连锁群数更接近于三疣梭子蟹染色体数。研究结果可为QTL定位和分子标记辅助育种（MAS）提供数据支持和理论依据。
2008年从三疣梭子蟹莱州湾野生群体中挑选个体大，无任何机械损伤及其他疾病、发育良好的种蟹（♂）作为父本，从海州湾野生群体中挑选个体大，无任何机械损伤及其他疾病、发育良好的种蟹（♀）作为母本，进行1♂ 3 3♀交配，2009年4月初培育出F1代家系。2009年8月从F1代家系中挑选符合上述条件的雌、雄蟹。按照1♂ 3 3♀的方式进行家系内交配，越冬后于2010年4月上旬培育出F2家系。同年8月下旬，随机取家系的110个个体及亲本，记录全甲宽、甲宽、甲长、体重等数据后，取蟹的大螯肌肉装入灭菌的1.5mL Eppendorf管中编号后置于冰箱中保存。
AFLP和SSR条带统计，分别按照显性和共显性标记统计（Van Ooijen et al，2001）。AFLP带型在电泳图上表现为有带和无带，有带（基因型AA/Aa）记为“1”，无带（aa）记为“0”，缺失条带记“—”，统计在一亲本中有带，在一个亲本中无带，子代条带按1：1分离的片段。SSR一对引物对某一个家系扩增反应只能产生一个基因座位，把一个等位基因作为同一位点对父母本分别统计。子代出现分离的条带经χ2检验后（P . 0.05），符合1：1孟德尔分离规律的标记用来构建三疣梭子蟹遗传连锁图谱。
本试验利用软件Joinmap 3.0 White head Institute进行连锁分析，采用LOD54.0，对所有标记进行分组，Calculate Map命令分析各组中不能参与连锁的标记，将其去掉后重新运行该命令，即可完成连锁图谱的绘制，图谱结果用MAPCHART2.1统一比例。
首先计算标记平均间隔（s），其值为图谱总长度除以间隔总数（标记总数减去连锁群数）。每个连锁群的标记平均间隔为连锁群长度除以连锁群上的间隔数，连锁群上的间隔数为连锁群上的标记数减去1。遗传连锁图谱实际长度为两个方面，一为框架图长度（Gof），二为包括三联体和连锁对在内的所有连锁标记的长度（Goa）。采用两种方法计算基因组预期长度（Ge）：
（1）Ge1：参照Fishman等（2001）。每个连锁群的长度加上标记平均间隔的两倍，来补偿连锁群最末端的标记和端粒距离。
（2）Ge2：参照Chakravarti等（1991）。每个连锁群的长度乘以系数（m11）/（m21），m为每个连锁群所包含标记的数目。
将两种方法的平均值作为中国对虾基因组预期长度Ge。
遗传图谱的实际长度分两个方面，一为框架图谱的长度Gof，二为所有连锁群的总长度，即包括连锁对在内的所有连锁群的总长度Goa（Cervera et al，2001）。相应的框架图覆盖率为Gof＝Gof/Ge，总的图谱覆盖率Goa＝Goa/Ge。
9.1.1 AFLP扩增结果
利用162对引物组合产生7875AFLP清晰条带，每对引物产生的条带数从40～80不等，片段大小在10～1.2.0 bp之间（表31）。每对引物产生的多态位点从2个至14个不等，平均每对引物产生7.6条多态性标记，低于斑节对虾（Wilson et al，2002），日本对虾（Li et al，2003）和太平洋白对虾（Zhang et al，2007），但与中国对虾（Liu et al，2010）的7.1个标记，三疣梭子蟹（罗云等，2010）的9.7个标记数相近。说明每对引物产生多态性标记数不同，相近或相同物种间差别不大，其他物种间差异明显。在已有报道中，AFLP标记一般均匀分布（Cervera et al，2001；Shen et al，2007），但是有些物种也有成簇存在的现象（Sakamoto et al，2000；Waldbieser et al，2001），本研究并未发现AFLP标记成簇分布的现象。相对均匀的标记基因组分布证明AFLP标记的高效性和成功率。
所有的多态标记中母本标记548个，父本标记504个，另有204个共同标记。在F2代分离比例符合孟德尔定律，即按照1：1或者3：1的比例进行分离。卡方检验表明，1 024个标记符合孟德尔分离定律，106个偏分离标记，偏分离位点数占总分离位点数的10.5%。最后，共919（ 87%）个标记定位到雌雄图谱上，133（13%）个标记未被定位。标记偏分离现象在图谱构建过程中普遍存在，已有研究表明DNA标记的偏分离现象与物种和构图群体有关。本研究中，标记偏分离率为10%，低于斑点叉尾
的16%（Liu et al，2003），海虾的12%（ Li et al，2006），太平洋牡蛎的27%（ Li et al，2004）。但却高于罗非鱼（Kocher et al，1998）和东部牡蛎的8%。偏分离标记的出现可能与以下因素有关：① 作图群体基因组信息差异（Truco et al，2007；Hwanget al，2009）；② 标记分型错误。此外，染色体丢失（Kasha et al，1970），基因转换（Nag et al，1989），同源重组（Armstrong et al，1982）等都可能导致偏分离现象的出现。
表31 162组MseI和EcoRI酶切引物组合产生的多态性条带统计
9.1.2 遗传连锁图谱分析
共528个分离标记用于雌性图谱的构建（图29），479个标记定位到框架图谱上，主要由457个AFLP标记、22个SSR构成。雌性框架图谱包括54个连锁群，其中不少于3个标记的有51个，图谱的长度为3.216.8 cm（Gof），连锁群的长度从13.1 cm（45号连锁群）到1.6.7 cm（1号连锁群），每个连锁的标记个数为2～53个。相邻标记间最大间隔为32.7 cm，图谱平均间隔为7.8 cm。各标记在雌性图谱上的分布情况见图29。
共496个分离标记用于雄性图谱的构建（图30），440个标记定位到框架图谱上，主要由421个AFLP标记、19个SSR构成。雄性框架图谱包括53个连锁群，其中不少于3个标记的有50个，图谱的长度为3.157.6 cm（Gof），连锁群的长度从4.7 cm到1.6.5 cm，每个连锁的标记个数为2～16个。相邻标记间最大间隔为30.9 cm，图谱平均间隔为8.8 cm。各标记在雄性图谱上的分布情况见图30。
采用两种方法估计三疣梭子蟹的基因组长度，取其平均值作为图谱预期长度，雌性和雄性图谱预期长度分别为4.745.2 cm和4.692.4 cm，雌性图谱预期长度和雄性图谱基本预期长度相等。图谱观察值占预期长度的百分比率为图谱的覆盖率，雌性和雄性框架图谱的覆盖率分别为67.8%和67.3%，当把连锁对考虑在内，三疣梭子蟹雌性和雄性连锁图谱观察长度分别增至3.521.3 cm和3.517.6 cm。雌性和雄性图谱覆盖率分别增至74.2%和75.0%（表32）。
51个和50个连锁群数十分接近三疣梭子蟹单倍体染色体数（n553）。基因组信息量庞大，可能与蟹类染色体数多和染色体之间的干涉有关。遗传图谱的长度反映了重组率的大小，但是本研究中，雌、雄图谱的总长度（Goa）分别为3.521.3 cm 和3.517.6 cm，十分接近。预期基因组长度分别为雄性4.745.2 cm和雌性4.692.4 cm。这种现象可能与作图群体的大小、做图标记数量和标记的密度有关。雌性和雄性常染色体的重组率一般不同，在XY染色体组型的哺乳动物中，雄性的重组率比雌性更紧凑（Nomura et al，2011）。已有关于甲壳动物性别决定的研究（Benzie，1998；Hulata，2001），尽管本研究中未发现性别相关染色体，但结果表明雄性的重组率比雌性更紧凑。其他关于甲壳动物的研究结果显示，雌性图谱比雄性图谱含有更多遗传标记。Staelens等（2008）构建了斑节对虾高密度遗传连锁图谱，雌、雄图谱的平均图距分别达到2.8 和2.1 cm，并发现雌性和雄性图谱的重组率差异不大。与本研究存在差异的原因可能是标记数的多少、图谱密度和物种的类别。本研究结果与Coimbra（2003）等报道的雌性1.176.4 cm和雄性1.1.5 cm图谱长度接近的结果相一致。图谱预期长度（雄性4.745.2 cm和雌性4.692.4 cm）明显高于罗云等（2010）（雄性2.918.2 cm和雌性2.372.4 cm），原因可能是标记数的增加。此外，919个标记定位到图谱上，远多于罗云等（2010）171标记。除标记数外，不同作图软件的应用也会导致图谱长度的差异。有研究（Senior et al，1997；Vuylsteke et al，1999）表明，对于基因组长度，同样的数据，JoinMap分析结果要短于MAPMAKER分析结果。
标记之间图距大于30 cm的雌性图谱44号连锁群（32.7 cm）和49号连锁群（30.1 cm），雄性图谱1号连锁群31.2 cm、29号连锁群30.1 cm和42号连锁群30.9 cm可能与基因高表达区的高重组率有关。相比罗云等（2010.22.0 cm和24.0 cm平均图距，本研究雌性7.8 cm和雄性8.7 cm更加精确，图谱覆盖率雌性和雄性分别为74% 和 75%，具有更好的基因组覆盖率。
遗传连锁图谱在QTL定位分析，基于图谱的基因克隆，MAS和比较基因组学方面都发挥着重要作用。三疣梭子蟹中密度遗传连锁图谱的构建主要有两个目标：首先，基因组覆盖率和标记密度增加为数量相关性状，如全甲宽、甲宽、甲长、体重等的QTL定位提供基础。第二，本研究为遗传分析和操作提供了一个有效的工具，可以作为单个基因位点、遗传进化和生态显著性状研究模板。最后，改进的图谱还可以为重要经济性状相关的比较基因组作图提供支持，为应用于分子标记辅助育种打好基础。
表32 三疣梭子蟹遗传连锁图谱参数统计
图29三疣梭子蟹雌性遗传连锁图谱
连锁群编号位于每个连锁群上方，AFLP 和SSR 分子标记在连锁群右侧，连锁群单位长度为厘摩（cM）
图30三疣梭子蟹雄性遗传连锁图谱。
连锁群编号位于每个连锁群上方，AFLP和SSR分子标记在连锁群右侧，连锁群单位长度为厘摩（cM）
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