核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）标记被称为第三代DNA分子标记。它是指染色体基因组水平上由于单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，其最少一种等位基因在群体中的频率不少于1%。作为最新一代的分子标记技术，SNP 具有很多优点：① 分布广泛，位点丰富，几乎遍布于整个基因组；② 在种群中是二等位基因型的，在任何种群中其等位基因频率都可估计出来；③ 遗传稳定性高；④ 部分位于基因内部的 SNP 可能会直接影响蛋白质的结构或基因表达水平，因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点；⑤ 由于其二态性，非此即彼，在基因组筛选中往往只需做1 /-的分析，易于进行自动化分析。
我们使用SOAPsnp软件从三疣梭子蟹转录组数据中发掘SNP标记，经过过滤条件筛选，去除潜在的假阳性位点。软件参数设置如下：① 一致性序列质量值小于20的位点；② 侧翼序列在基因组上拷贝数大于3的；③ SNP之间的最小距离小于5；④ reads覆盖深度小于5或大于10 000。
通过分析，最终共获得66191个SNP座位，平均809个碱基1个SNP位点。23 734个为转换型SNP（Ts），42457个为颠换型SNP（Tv）。Ts：Tv为1：1.79。有报道显示在罗氏沼虾和日本沼虾中，Ts：Tv的比值分别为1.32：1.00和1.99：1.00，与本研究结果存在显著差异，说明Ts：Tv比值在甲壳动物中可能存在显著物种特异性，尚需进一步研究揭示其原因。获得SNP中AT/TA，AG/GA 和 CT/TC类型占绝大多数，而GC/ CG类型占的比例最低（图22）。
图22 SNP类型分布图
为了筛选生长相关SNP标记，我们从同一养殖池塘中挑选体重具体显著差异的个体各45只（小个体SG，大个体LG），建立生长性状差异群体。结合候选基因法从差异表达基因中筛选19条unigene序列，根据序列设计20对引物，以混合DNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物进行双向末端测序，并与转录组unigene序列进行比对，通过分析测序峰图筛选潜在SNP位点（图23）。根据序列及SNP座位所在位置信息，利用SpectroDE- SIGNER软件设计引物（表19），利用Mass ARRAY iPLEXTM 基因变异技术，采用先进的MALDI-TOF 质谱技术和spectrochip 芯片技术，在生长性状差异群体中对SNP 基因型进行分析。
最终我们成功扩增了17.3.7 bp长的DNA片段，筛选出74个SNP位点，SNP分布频率为0.43.100 bp。转换突变的比例为 80%，颠换的比例为20%，转换的比例远远大于颠换，符合“transition bias”原理。C/T（G/A）突变所占比例为60%，所占比例最大，G/T（C/A）为20%，A/T为9.33%，G/C 为10.67%。在其他物种中也同样发现了上述的规律。出现这种规律一是因为C碱基容易发生5-甲基化转换突变为T碱基，突变频率是其他碱基突变的10倍；第二个原因是 CpG 岛5-甲基胞嘧啶非常频繁发生的脱氨基作用。通过分析突变前后的碱基比例发现，A1 T所占的比例在突变之后增加了，A/T突变的频率高于G/C，这种现象可以用热力学原理来进行解释：在DNA中，碱基之间是通过氢键来进行连接的，G和C碱基之间有三个氢键，而A和T之间只有两个，所以GC碱基配对比AT更加坚固，更加不易发生突变。在果蝇（Drosophilamelanogaster）和哺乳动物中同样发现在碱基替换之后A1 T的比例增加。另外还发现内含子中突变发生的频率远远高于外显子（内含子为1.34.100 bp，外显子上为0.17.100 bp），表明外显子中的碱基更加保守。
利用飞行质谱法分型，并通过一般线性模型多元方差分析和卡方检验分析发现3个与生长性状显著相关的位点，其中包含一个错义突变，一个同义突变，还有一个未知的突变（表20）。众所周知，大约20%的错义突变会改变最终合成的蛋白质。错义突变改变性状的机理是通过改变氨基酸从而改变最终合成的蛋白质。而同义突变改变性状的机理就比较复杂：① 改变蛋白质的二级结构以及mRNA的翻译速度，② 使常规密码子突变为稀有密码子从而改变合成蛋白质的效率，③ 产生一个隐藏的mRNA剪接位点和尾序列，④ 位于重叠基因区域的突变可能影响其他的基因表达。本研究中的SNP位点导致性状改变的机制还需要进一步的研究阐明。
图23 测序峰图：叠峰代表SNP座位
表19 引物设计列表
续表
图24 SNP分型PLOT图
表20 SNP位点与生长性状的关联分析
注：*表示显著相关（P , 0.05）；**表示差异极显著（P , 0.01）。
（作者：张德宁，吕建建，刘萍，冯艳艳，高保全，李健）
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