三疣梭子蟹-基因的克隆及相关核受体基因在蜕皮中的功能分析

核受体（nuclear receptor）是多细胞生物中含量最丰富的几大类转录因子超家族之一，机体的生长发育、细胞分化以及许多生理、代谢过程都可归于核受体与相应配体及其他调节因子的相互作用（Baulieu E et al，1976）。在哺乳类中，FTZ-F1可归于核受体第5家族：甾类激素受体，这一家族也包括重要的甾类（类固醇）合成调控因子SF-1。FTZ-F1作为转录因子激活果蝇（Drosophila）早期胚胎形成阶段分化基因fushi tarazu的同源异性盒（homeobox）而被发现的（A K et al，1984）。在DNA结合结构域和FTZ-F1 box区域都有相对的高度保守性，调控昆虫蜕皮、变态、生殖等生理过程。此外，也有研究证明FTZ-F1在表皮基因以及表皮蛋白的沉积上具有不可替代的作用（M Y et al，2000）。然而有关FTZ-F1基因在甲壳动物蜕皮中的功能尚无报道。开展该基因在蜕皮中的功能研究，有助于阐明FTZ-F1、EcR和RXR基因在三疣梭子蟹中与蜕皮激素相互作用与调控关系，进一步丰富三疣梭子蟹蜕皮过程分子调控机制的研究。

三疣梭子蟹FTZ-F1基因cDNA序列全长为1.7.3　bp（GeneBank登录号：KP299258），其中包括588 bp的开放阅读框（ORF），141 bp的59端非编码区（UTR），1.0.4　bp的39端非编码区（UTR）。39端含有一个PolyA尾和一个多聚腺苷酸加尾信号（AATAAA）（图18）。DNAstar软件分析表明，三疣梭子蟹FTZ-F1基因编码一个由195个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为22.8.3　103理论等电点为6.35。ProtParam tool软件分析表明，FTZ-F1蛋白带有负电的氨基酸残基为26个（Asp和Glu），带有正电的氨基酸残基为23个（Arg和Lys），不稳定系数为27.7，亲水性平均数为-0.291，属于稳定蛋白。使用SMRAT和InterProScan在线软件分析，FTZ-F1基因翻译的蛋白质结构中无跨膜结构域。使用signa lP分析FTZ-F1的信号肽，结果显示mean.S值小于0.5，不存在信号肽。BLAST同源性分析显示，三疣梭子蟹FTZ-F1蛋白的氨基酸序列与刀额新对虾（Metapenaeus ensis）FTZ-F1的氨基酸序列同源性达到75.4%，与其他物种如切叶蚁（Acromyrmex echinatior）、德国小蠊（Blattella germanica）、黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）、烟草天蛾（Manducasexta）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）FTZ-F1的氨基酸序列的同源性分别为66.0%、67.5%、61.9%、61.9%和66.0%（图19）。

图18　三疣梭子蟹FTZ-F1基因cDNA全长及其编码的氨基酸序列

ATG：起始密码子；*：终止密码子；下划线：FTZ-F1基因保守结构域；方框：配体结合位点。

图19　三疣梭子蟹FTZ-F1氨基酸序列与其他物种的FTZ-F1氨基酸序列比对

实时定量分析FTZ-F1在不同蜕皮时期各个组织中的相对表达情况（图20），得知眼柄中FTZ-F1的表达量为蜕皮后期高于蜕皮前期和蜕皮间期，而在肝胰腺、心脏和鳃组织中FTZ-F1基因的表达量为蜕皮后期低于蜕皮前期和蜕皮间期。推测在眼柄中，该基因与20E呈负调控关系，而在肝胰腺、心脏和鳃中该基因与20E呈正调控关系。由于眼柄中X器-窦腺复合体合成蜕皮抑制激素（MIH）（T N et al，2000），因此该基因在眼柄中的表达可能与MIH更为相关。对核受体基因EcR在蜕皮周期中的定量分析结果显示（图21），眼柄、心脏和鳃组织中，EcR基因在蜕皮前期表达量高于其他两蜕皮时期，表达模式与20E在蜕皮时期的浓度变化相似，说明了该基因与20E的协同调节作用。在血细胞、肝胰腺和肌肉中，EcR的表达模式为蜕皮后期高于蜕皮前期高于蜕皮间期。推测EcR基因除了作为蜕皮激素的受体与之进行协同调节外，在蜕皮后期还具有其他的调节功能。核受体基因RXR在蜕皮周期的定量结果显示（图22），RXR与FTZ-F1基因在肝胰腺、心脏和鳃组织中的表达模式呈现出完全相反的趋势，这预示着RXR和FZT-F1之间存在着一定的拮抗作用。而RXR与EcR基因在整体上呈现相似的表达模式。由于RXR和EcR是20E异二聚体复合物的组成部分，因此这两个基因在三疣梭子蟹的蜕皮调控上也许更趋向于协同作用。

图20　三疣梭子蟹FTZ-F1基因在不同蜕皮时期各个组织中的表达情况

图21　三疣梭子蟹EcR基因在不同蜕皮时期各个组织中的表达情况

图22　三疣梭子蟹RXR基因在不同蜕皮时期各个组织中的表达情况

图23　蜕皮前期，去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中FTZ-F1基因的相对表达情况

图24　蜕皮间期，去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中FTZ-F1基因的相对表达情况

图25　蜕皮后期，去除单侧眼柄的三疣梭子蟹和正常三疣梭子蟹各组织中FTZ-F1基因的相对表达情况

甲壳类蜕皮激素是由Y器官合成与分泌，而Y器则受MIH的调控（Chang E S et al，1977；Cs T et al，2002）。眼柄中X器-窦腺复合体是MIH制造与分泌的器官，去除单侧眼柄将会造成20E浓度的上升（Molyneaux D B et al，1988；Devaraj H et al，2006）。去除单侧眼柄后对FZT-F1基因在各个组织中的表达量进行分析（图23、24、25），发现在去除单侧眼柄后该基因的表达量在各个蜕皮时期组织中出现明显下降；说明20E浓度的升高对FTZ-F1基因的表达起到了明显的抑制作用。由此可以推测出，FTZ-F1基因在蜕皮过程中具有重要的作用，与20E具有紧密的联系，且更可能为抑制调控关系。