核受体是一类在生物体内广泛分布的配体依赖性转录因子，核受体与相应的配体及其辅调节因子相互作用，调控基因的表达（M R et al，2003）。蜕皮激素与核受体家族中的蜕皮激素受体（EcR）以及超气门蛋白（USP）形成异二聚体启动蜕皮级联反应，作为一条典型的蜕皮激素通路在昆虫中具有广泛的研究。HR38作为孤儿受体家族的成员，是除蜕皮激素受体（EcR）之外，唯一一个能与过剩气门蛋白（USP）形成异二聚体的核受体。在果蝇（Drosophila）的研究中发现并证明了HR38调节了另外一条非典型的蜕皮激素信号通路（Baker K D et al，2003）。除此之外，也有研究证明HR38在调控蜕皮激素早期应答基因、碳水化合物的代谢、表皮的形成等方面具有重要的作用（Sutherland J D et al，1995；Hilliker A et al，2007；Ruaud A et al，2011）。尽管HR38在昆虫中具有比较深入的研究，但是水生甲壳类中关于HR38的报道却十分罕见。我们从实验室构建的三疣梭子蟹转录组文库中获得一个HR38的EST序列，对该基因进行全长克隆、生物信息学分析以及在蜕皮周期表达分析，初步探讨其与蜕皮激素之间的联系。
三疣梭子蟹HR38基因（PTHR38，GenBank登录号：KP954701）全长2.9.0 bp，包括2.2.8 bp的开放阅读框（ORF），101 bp的59端的非编码区（UTR）和551 bp的39UTR（图26）。该基因编码一个由765个氨基酸组成的蛋白质，预测相对分子质量为84.2 3103，理论等电点为6.3。采用Interpro Scan在线软件分析，PTHR38属于孤儿受体家族，具有核受体锌指结构、DNA结合结构域（DBD）和配体结合结构域（LBD），没有跨膜结构域。采用ProtParam tool软件分析，该基因负电荷的氨基酸残基总数（Asp1 Glu）为74，正电荷的氨基酸残基总数（Arg1 Lys）为65，不稳定系数计算值为64.49，亲水性平均数为20.473，是一类不稳定的蛋白。
图26 三疣梭子蟹HR38基因cDNA全长及其编码的氨基酸序列
ATG：起始密码子；*：终止密码子；方框：DNA结合区；下划线：配体结合区。
图27 HR38氨基酸序列比对
利用NCBI BLAST对三疣梭子蟹HR38基因编码的氨基酸序列进行比对，发现该序列与大型蚤（Daphniamagna）的HR38相似性最高，为70.6%。与其他物种如印度跳蚁（Harpegnathossaltator）、黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、佛罗里达弓背蚁（Camponotus floridanus）、剑水蚤（tigriopus japonicus）和意蜂（Apismellifera）的HR38的相似性分别为67.3%、 60.4%、55.3%、52.7%、50.5%、48.0%和45.7%（图27）。利用MEGA6.0软件进行系统进化分析表明，切叶蚁、印度跳蚁和意蜂HR38亲缘关系较近，三疣梭子蟹PTHR38与昆虫HR38亲缘关系较近，与蚤类亲缘关系较远（图28）。
对三疣梭子蟹HR38在蜕皮周期的各个组织中进行实时定量分析（图29），结果表明：该基因在蜕皮周期的各个组织中均出现不同程度的差异表达现象，说明PTHR38参与到三疣梭子蟹的蜕皮调控过程中。这与Kozlova等关于HR38在整个发育时期都表达这一结论相一致（Kozlova T et al，1998）。血淋巴中该基因的表达量在蜕皮前期高于蜕皮间期和蜕皮后期，这个表达模式与血液中20E的浓度变化相一致，推测PTHR38在三疣梭子蟹中也与蜕皮激素具有一定的相互作用。眼柄中HR38在蜕皮后期明显降低，也说明了PTHR38与蜕皮激素具有相互的联系，但是具体的作用关系还有待于进一步的探讨。有研究表明，HR38参与到碳水化合物的代谢和糖原的合成（Af R et al，2011）。肌肉和肝胰腺中，该基因在蜕皮后期表达量高于蜕皮前期和蜕皮间期，推测该基因在三疣梭子蟹中可能参与能量物质的代谢。
图28 MEGA 6.0软件采用邻接法构建的三疣梭子蟹与其他物种的HR38氨基酸的系统进化树
注：分叉处数值表示1 000次重复抽样所得到的置信度，只显示置信度 . 80%的数值；标尺长度代表每个位点发生0.1次置换。
图29 三疣梭子蟹HR38基因在不同蜕皮时期各个组织中的表达分布情况
注：同一组织内，不同字母之间为差异显著（P , 0.05），相同字母之间为差异不显著（P . 0.05），下同。
图30 去除单侧眼柄后PTHR38基因在三疣梭子蟹蜕皮前期与正常对照各个组织中的相对表达情况
图31 去除单侧眼柄后PTHR38基因在三疣梭子蟹蜕皮间期与正常对照各个组织中的相对表达情况
图32 去除单侧眼柄后PTHR38基因在三疣梭子蟹蜕皮后期与正常对照各个组织中的相对表达情况
甲壳类的神经内分泌调节中心：X器-窦腺复合（XO-SG）体着生于眼柄基部。XO-SG合成和分泌蜕皮抑制激素（MIH），MIH作用于Y器官从而抑制蜕皮激素的合成（Chung J S et al，2003；Hopkins P M et al，1992）。去除单侧眼柄，可以减小MIH对Y器的抑制作用，使体内蜕皮激素水平增高（Kj L et al，1998；Zarubin T P et al，2009）。对去除单侧眼柄后，PTHR38在各个组织的表达情况进行定量分析（图30、图31、图32），结果表明：去除单侧眼柄相对于正常对照，PTHR38基因的表达量在整体上呈不同程度的上升趋势，推测三疣梭子蟹HR38基因的表达量与蜕皮激素水平呈协同作用。但是在各个时期的肝胰腺中，去除单侧眼柄造成了PTHR38表达量的降低。由于HR38参与碳水化合物的代谢和糖原的储存，并且蜕皮伴随着能量消耗的过程。因此推测，在三疣梭子蟹肝胰腺中，PTHR38基因的表达受营养状况与蜕皮激素水平双因素影响。
（作者：张龙涛，吕建建，高保全，刘萍）
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