第四节 流式细胞术样品的制备
一、单细胞样品的分离
（一）新鲜实体组织单分散细胞的制备
1.酶消化法 作用原理为破坏组织间的胶原纤维和弹性纤维，水解组织间的黏多糖等物质，水解组织细胞间起连接作用的蛋白质。该法是实体瘤和培养细胞分散成单个细胞的主要方法。蛋白酶类释放组织中的细胞，胰酶水解脂键和肽键，胶原酶降解几种分子类型的胶原，溶菌酶水解糖蛋白和肽的糖苷键。
2.机械法 机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液。采用网搓法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用。①剪碎法：将组织剪碎至匀浆状，过滤（100目）、离心（1000/700r/min，5分钟），再过滤；②网搓法：在100、300目的尼龙网上轻搓组织块，离心（700r/min）；③研磨法：组织剪碎至小块置研磨器中，加2ml生理盐水，用研棒研至匀浆，生理盐水冲洗过滤（300目）、离心。
3.生物化学试剂处理法 生物化学处理是将在组织细胞间黏着中起作用的Ca2＋和Mg2＋置换出来，同时酶解细胞间的连接，从而使细胞分散开来。
（1）实验方法：①将组织切成薄片，置入试管中；②首先加入0.2%EDTA 5ml，室温下30分钟，离心弃之；③再加入0.062胰酶－0.1%EDTA 5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30分钟；④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000r/min，5分钟，再用生理盐水洗2～3次；⑤细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞存活率低、产量低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定。化学试剂可单独使用，也可与其他方法联合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的流式检测结果。
（2）注意事项
1）对新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死以及细胞自溶，影响流式测定结果。
2）根据实验目的选择最佳的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。
3）酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化的影响。
4）需根据不同组织选择相应的方法，如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法，往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的分散单细胞。
5）在使用酶学方法时要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。因为胶原酶具有在Ca2＋和Mg2＋存在，或在血清状态下不出现活性降低的特性。
（二）石蜡包埋组织样本的制备
1.制备方法 切片至少50μm厚，脱蜡、水化，80%甲酸（内含3%H2O2）在－18℃处理30分钟，用胰酶或蛋白酶消化，终止后过滤（200目），离心、重悬。
2.注意事项
（1）一定要将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第一遍应进行12小时左右，第二遍为30分钟左右。检测是否将石蜡已脱净的方法是用二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净；反之，则蜡尚未脱净。
（2）切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
（3）消化前组织应先用眼科剪刀剪碎，再加胃蛋白酶消化30分钟，然后用尖吸管吹打成悬液状。
（4）消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞膜被消化。
（5）如消化后的组织悬液经过200目尼龙网过滤后细胞数很少，那么可以将消化组织放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下。如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
（三）外周血单个核细胞样本的制备
血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血液在生理状态下呈分散的游离状态。它是流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板，而其中白细胞主要成分又分为多形核细胞和单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）。在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。单个核细胞样品制备程序如下。
（1）取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4ml，混匀。
（2）将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液的液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态。
（3）以2000r/min离心30分钟，室温18～20℃，离心后可见试管内的血液清楚地分为4层［上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层］。
（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出收集到另一试管中，用生理盐水洗两遍，每次均以1500r/min，离心10分钟。弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液。
（5）用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。
（四）骨髓细胞单细胞悬液的制备
1.制备方法
（1）无菌抽取骨髓液0.5ml。
（2）将骨髓标本滴入含1000U/ml肝素抗凝剂的1ml PBS液中。
（3）再加入PBS液稀释至10ml。
（4）用吸管吸取5ml稀释骨髓液徐徐加入盛有4ml的人类淋巴细胞分离液液面之上。
（5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS和淋巴细胞分离液之间形成的界面上。
（6）吸取有核细胞层，加入到10ml PBS液中，混匀。
（7）以1000r/min离心5分钟，弃上清液；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。
2.注意事项
（1）抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中。
（2）在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，吸取量应掌握在300μl左右，这样有利于洗去多余的分离液。
（3）溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现立即加入大量生理盐水，混匀、离心，去除上清即可。
（五）培养细胞
收集悬浮细胞于试管中。贴壁细胞事先用酶消化后制成单细胞悬液，悬浮细胞合并。然后以300g离心5分钟，用缓冲液重悬细胞。
二、流式细胞样品荧光标记
（一）荧光素发射荧光的基本原理
当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，应用各种荧光素也是必不可少的，它包括单标记、双标记和三标记荧光素等。荧光素发射荧光的原理是：荧光素受到一定波长的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原来运动处于基态轨道跃迁到激发态轨道，然后当电子由激发态重新回到基态时，释放出能量并发射出一定波长的荧光。不同荧光素用不同波长的激光来激发，所以要选择正确的激光器。如FITC和PE的激发波长均为488nm，所以可以用产生可见光的氩离子激光器，而APC和PC5等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm波长红光的氮－氖激光器。
此外，各种荧光素的发射波长也十分重要，可以据此确定其检测所需光电倍增管性质。如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1），PE则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5和PerCP等发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3或PMT4）等。
（二）常用荧光素的基本生物学特性
1.核酸荧光染料
（1）溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）：都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰更向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA分布的变异系数（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
（2）4，4，6－二脒基二苯基吲哚（DAPI）：可以非嵌入方式与DNA链的A－T碱基对特异结合，在紫外线下激发蓝色荧光，是一种理想的DNA定量和周期分析的荧光染料。
（3）Hoechst染料（HO）：包括HO33324、HO33258、HO33378和HO33662，以非嵌入方式与DNA链的A－T碱基对特异结合，在紫外线下发蓝色荧光。可对活细胞直接染色而不需要在膜上打孔。
（4）吖啶橙（AO）：可以两种方式与DNA、RNA结合：①嵌入式结合，主要是与DNA双链结合；②静电力结合，主要是AO与RNA单链结合。在Ar2＋激光器488nm波长的激发下，AO与DNA结合发出530nm绿色荧光，与RNA结合发出640nm红色荧光。进行RNA单参数分析时，需用DNase处理细胞，以排除AO与DNA结合的荧光的干扰。在进行DNA、RNA双参数分析时，通常用EDTA使RNA双链变为单链，同时可保持DNA双链不变，这样可使AO更好地与核酸结合。
（5）派若宁（PY）：是一种碱性染料，可与胞质、核仁中的RNA单链结合，在488nm激光的激发下发出580nm的红光，是对RNA进行单参数分析的一种很好的染料。但PY也可以与单链DNA结合，样品需事先用DNA酶去除DNA的影响。
2.单克隆抗体标记荧光探针
（1）FITC：为一种小分子荧光素，是一种最为常用的荧光探针，最大吸收峰为495nm，用488nm的激光激发后发射荧光的峰值在520nm附近，使用530±15nm的带通滤光片可获得最佳的荧光检测信号。FITC及其衍生物可以共价键的方式标记在多种抗体、抗原、亲和素及蛋白上。FITC的荧光强度可受溶液的pH值影响，当pH值下降时其荧光强度也随之减弱。
（2）PE：其相对分子质量较大，约为240000，故可能会对其他大探针产生空间位阻。但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。PE的最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm。对于只配有单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，可达到最佳荧光检测效果。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。因此，用不同公司生产的PE可能会得到不同的结果。
（3）别藻青蛋白（APC）：是一种在青藻中发现的自然荧光素，最大吸收峰为650nm，发射荧光的峰值为660nm，使用660±10nm的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。APC适用于配有双激光管的流式细胞仪进行多色分析，它可被600～640nm波长的激光激发。因此，通常使用633nm的氦－氖激光器进行激发。
（4）德州红（Texas red）：是硫罗丹明101的磺酰氯衍生物，最大吸收峰为596nm，被595～605nm范围的激光激发后，发射荧光峰值为620nm，使用620±10nm的带通滤光片。德州红所发射的荧光处于红光范围的最远端，几乎不会与FITC的光谱相重叠。但德州红与PE双标进行多色分析时，应使用配有双激光管的流式细胞仪，其中一种为可调的染料激光器，以免有激发光干扰PE检测器。
（5）叶绿素蛋白（PerCP）：是一种蛋白复合物，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm波长的激光激发后，发射光的峰值在677nm。PerCP与FITC，PE进行多色荧光染色时荧光光谱重叠很小，容易使用，但PerCP的量子产量不高，最好应用在检测表达较高的抗原上。
（6）藻红蛋白偶联物（PE－Cy5）：为吲哚羰花青衍生物，最大吸收峰为640nm，单独使用时可被氦－氖激光器（633nm），半导体激光器（635～650nm）和氪离子激光器（647nm）有效激发。但目前广泛以藻红蛋白偶联物的形式应用。PE－Cy5可与PE，FITC同时使用，用单个激光器激发进行三色分析，3个荧光间不需要进行太多的荧光补偿。
（7）藻红蛋白偶联物（PE－Cy7）：是PE与花青苷类燃料Cy7的偶联结合物。在流式细胞分析中，PE－Cy7可以与FITC，PE同时使用，接受488nm单激光激发，而PE－Cy7发射的荧光与FITC无重叠。PE－Cy7也可与APC搭配使用，荧光补偿小。
（三）常规荧光样品的制备方法
1.直接免疫荧光标记法 取一定量细胞（约106个/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH值为7.2～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬上机检测。本方法操作简便、结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
2.间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液（约106个/ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原－抗体－抗抗体复合物，以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以，标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用于测定细胞数较少的标本。
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