海洋微生物的群体定量

1.显微镜直接镜检计数法

除吖啶橙（acridine orange）外，还有其他一些荧光染料如4′6-二酰胺 -2-苯基吲哚（4′6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、Yo-Pro-I和SYBR Green I等也可与细胞中的核酸物质特异性结合，从而被用于海洋细菌的荧光显微计数。用荧光显微计数法对那些体积微小的细菌进行计数，比使用普通光学显微镜和相差显微镜计数更为准确。

（1）吖啶橙直接镜检计数法（AODC法）。

AODC法是测定水样中细菌总数最常用的方法之一。Fransisco等（1973）最早应用AODC法计数自然水体中的细菌总数，并确定了其基本程序，后来几经改进而成为现在比较通用的细菌总数计数法。AODC法的基本原理是吖啶橙分子可以和细菌细胞中的核酸物质特异性结合，在450～490nm波长的入射光激发下，吖啶橙与RNA或单链DNA结合发橙红色荧光，与双链DNA结合发出绿色荧光。处于不同生理状态的细菌细胞可以发出不同颜色的荧光。如处于快速生长状态的菌体细胞内含有较多的RNA和单链DNA，它们与吖啶橙结合后，在荧光显微镜下呈现橙红色荧光；处于不活跃或休眠状态的菌体细胞内的主要核酸成分为双链DNA，与吖啶橙结合后，会发出绿色荧光；死亡的细菌细胞中的DNA被破坏成单链的DNA，结合吖啶橙后，亦呈现橙红色荧光。另外，菌体的荧光颜色也和样品的处理过程关系密切。

AODC法中可使用落射光荧光显微镜观察菌体发射的荧光。落射光荧光显微镜克服了透射荧光显微镜的许多不足，不仅可以用于多种水环境及沉积物样品的细菌测定，也可用于水下物体表面附着细菌的直接计数，包括像钢片、塑料等不透明物体表面细菌的测定，大大增加了荧光显微计数法的应用范围。目前，将落射光荧光显微镜与影像分析仪及电脑联机，使得测定水体中细菌数量、体积及生物量的过程实现自动化。

计数时在荧光显微镜蓝光道、油镜条件下，随机取10个视野，对具有细菌形态呈亮绿色的细胞计数，每个样品至少计数300个菌体。按下列公式计算样品中的细菌数量。

BN＝Na×S/[Sf ×（1－0.05）×V]

式中 BN——样品含菌数，单位为个每升（cells/L）；

Na——各视野平均菌数，单位为个（cell）；

S——滤膜实际过滤面积，单位为平方毫米（mm2）；

Sf——显微镜视野面积，单位为平方毫米（mm2）；

V——过滤样品量（式中0.05为加入37%～40%甲醛占固定样品总体积的比例），单位为升（L）。

（2）活菌直接镜检计数法。

长期以来，困扰微生物生态学者的一个主要问题就是大多数能在显微镜下观察到的细菌，却无法用常规培养法计数。有研究结果表明，在大洋的样品中，用琼脂平板计数法所得的结果只有直接镜检计数法所得结果的0.1%。由于AODC法不能区分活细菌、死细菌以及非生命颗粒，所以用镜检计数法计数结果往往偏高。1979年，Kogure等将荧光显微技术与培养法结合起来，设计出活菌直接镜检计数法（DVC），较好地解决了水环境中活细菌的计数问题。

DCV法是在AODC法基础上发展而成的一种活菌直接镜检计数方法。其基本原理是先向海水样品中加入微量的酵母膏和萘啶酮酸（nalidixic acid）进行一段时间的预培养，然后再用AODC法计数。萘啶酮酸是DNA促旋酶（gyrase）的抑制剂，而促旋酶在依赖ATP的反应中，能催化将负超螺旋引入双链DNA中。促旋酶由两个亚基组成，A亚基负责DNA链的剪切和链接，B亚基负责水解ATP。萘啶酮酸能作用于复制基因，使之在无ATP的情况下，不能将负超螺旋引入DNA中，从而切断DNA的合成。萘啶酮酸能抑制细菌DNA的复制，但不影响细菌中其他合成代谢途径的继续运行。具有代谢活性的细菌能够吸收营养物质，在一定浓度营养物质的存在下，并在萘啶酮酸的刺激下，菌体可生长、伸长、变粗，但不分裂。经过预培养的水样再用吖啶橙进行染色，用荧光显微镜观察计数。由于这些增大了的细菌细胞处于生长阶段，所以细胞内含有较多的RNA，与吖啶橙结合后发橙红色荧光；而那些不活跃的细胞，一方面个体较小，另一方面，由于细胞内含有较少的RNA，与吖啶橙结合后发绿色的荧光。这样就可以很容易计数水样中的活菌数，同时可以计数总菌数。

（3）四氮唑还原法。

四氮唑还原法是由齐默尔曼等（1978）建立的一种用于计数水环境中具有呼吸活性的细菌的方法。其理论依据是，所有活的细菌均具备电子传递系统（electronic transfer system，ETS），这可以通过添加人工电子受体（活菌指示剂）的方法检测出来。当以2，3，5-氯化三苯基四氮唑或称红四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）为人工电子受体时，在活细胞内TTC在呼吸链中接受来自1，5-二氢黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）的氢，并使自己还原成红色的2，3，5-三苯基甲臜（triphenyl formazan，TF，遇氧气不褪色），显微镜下即可见细胞内出现暗红色的斑点。

2.培养计数法

（1）涂布平板计数法。

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成的这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其呈单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

涂布平板计数法是分析可培养细菌最常用的方法。由于没有一种培养方法是适合于所有海洋细菌的，平板上生长的并不是样品中实际的总活菌数，所以该方法只能计数一部分海洋细菌的数目。如果改变培养基的配方、pH、培养温度及通气条件，用此法还可测得不同生理类型的活细菌数目。由于99%以上的细菌在现有的人工培养基上是不能被培养的，所以利用涂布平板方法计数，结果比实际值约小两个数量级。这是涂布平板计数法的局限性。但是，该方法具有可以同时获得纯培养物的优点，而且在实际应用中，该方法在检测环境中普通异养菌数量时，仍然具有较大的应用价值。

目前，我国的《海洋调查规范》中规定，用Zobell 2216E海洋琼脂平板来计数海水和沉积物中可培养的总异养菌数，因为这种培养基适合于寡营养要求的海洋细菌生长。用弧菌选择性培养基—TCBS平板可以对绝大多数弧菌的总数进行计数。

（2）最可能数（most probable number，MPN）计数法。

1915年，McCrady首次发表了用MPN法（最可能数计数法）来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可按概率理论计算菌数。微生物检测中MPN法一般采用3管法或是5管法，即每个样品有3个以上的稀释度，每个稀释度接种3管或5管平行检测管，培养一定时间后根据3个有效稀释度的阳性管数计算出样品的含菌量。MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的一种间接计数法，虽然实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在置信区间内的任何一点。因此MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。

（3）微孔滤膜计数法。

该技术已在前面“海洋微生物的培养和分离纯化”部分有所介绍。

3.流式细胞仪计数法

流式细胞术（flow cytometer，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。最早期流式细胞仪被用于检测矿尘中飞浮质颗粒；第二次世界大战中美军实验室用其检测细菌和孢子；20世纪40年代末，报道显示流式细胞仪可用于检测细菌样本、悬浮颗粒；20世纪70年代，随着商业流式细胞仪的发展，用流式细胞仪研究哺乳类生物细胞发展迅速。随着流式细胞仪光学系统的改进及发现新的荧光素，流式细胞仪在微生物学中的应用开始发展。20世纪90年代末，微生物学对流式细胞仪的应用快速发展起来，可用于鉴别死 / 活细菌和酵母菌并计数、区分革兰氏阳 / 阴性细菌、研究酵母菌细胞器、探讨病毒细胞相互作用以及病毒引起的细胞凋亡等。

在很多微生物学应用方面，正确地鉴别和测定细菌死活和细菌总数很重要。传统的培养检测方法耗时，且对于不可培养的生物体，不能提供实时的结果或及时的信息。流式细胞仪可以分析细菌的生存、新陈代谢作用和抗原标志。而且流式细胞仪能够应用于检测样本中可繁殖的细菌。活细胞有完整的细胞膜且不渗透染料如PI染料，这是唯一一个能渗透受损细胞膜的染料，而TO是渗透染料能够进入所有的细胞，包括活的、死的、不同程度的细胞。对革兰氏阴性细菌，用EDTA损耗多脂糖层很容易促进TO上调。因此，结合这两个染料提供一个快速、可靠的方法来区别细菌的死活。BD Liquid Counting Beads（BD Biosciences，San Jose，CA），即流式细胞仪定量微球，能够用于精确地定量样本中细菌的总数及死活。