扫描电镜的样品制备

扫描电镜样品制备的要求是:尽量使样品表面结构保存完好、无变形和无污染,样品应干燥,且导电性良好。

(一)常规扫描电镜生物样品制备

常规扫描电镜生物样品制备的过程主要包括:取材、清洗、固定、脱水、干燥和导电处理。

1.取材 用锋利刀片迅速取材,样品大小一般为(3~5)mm×(1~1.5)mm。操作要轻巧敏捷,严防造成样品牵、拉、挤、压。在能满足所需要观察内容条件下,样品块应尽量小。扫描电镜观察的生物样品,一般是组织或细胞表面,切取前必须确认所取的部位,避免误取,必要时可标记标本的观察面。

2.清洗 清洗样品表面十分重要,通过清洗可去除杂质及污物,充分暴露样品表面的微细结构。这是扫描电镜取得正确结果的必需条件。清洗方法有以下几种。

(1)等渗生理盐水或缓冲液清洗:一般用等渗生理盐水或浓度0.1mol/L的磷酸缓冲液。

(2)超声振荡法处理:应根据样品的大小及污染程度严格控制超声清洗的频率和功率,以防强度过大或时间过长引起样品破碎变形。

(3)酶消化法处理:蛋白酶在去除表面黏附物同时也会破坏样品表面蛋白质,操作时应严格控制浓度、温度和时间。

固定后样品清洗大多选用相应的缓冲液,但制样过程中,每更换一次试剂,为了消除可能出现于样品表面的反应沉淀物,一般都要用双蒸水清洗。

3.固定 常用戊二醛-锇酸双重固定法。在4℃条件下,样品清洗干净后放入2.5%戊二醛固定液固定2~4h;用配制固定液的缓冲液漂洗,至少3次,时间为0.5~2h,再用1%锇酸固定液固定1h。

4.脱水 脱水之前需用缓冲液清洗样品3次,每次10min。脱水剂为乙醇或丙酮,用“梯度脱水法”,逐步取代样品中的水分。脱水剂浓度由低至高依次为30%、50%、70%、80%、90%、100%(2次),每级浓度脱水时间为10min。细胞样品脱水时间可适当缩短。

5.干燥

(1)临界点干燥法:临界点干燥法是利用物质在临界状态时表面张力等于零的物理特性,使样品中液体完全气化、排出,达到完全干燥的目的。这可以避免表面张力的影响,较好地保存样品的微细结构。此法操作较简单,一般2~3h即可完成,是目前最常用的干燥方法。临界点干燥需在临界点干燥仪中进行,操作步骤如下。①置换:样品脱水至100%乙醇或丙酮后,用纯丙酮置换15~20min。②转入中间液:将样品由纯丙酮转入中间液(醋酸异戊酯)15~30min。③移至样品室:从中间液中取出样品,放入样品盒,移入临界点干燥仪的样品室,盖好盖并拧紧,以防漏气。④液态CO2置换醋酸异戊酯:打开进气阀,慢慢注入液态CO2,然后稍开排气阀,以5L/min的流量排出样本室中的原有气体。此时可闻到醋酸异戊酯气味,待气味消失后,关闭排气阀。通过观察窗观察室内液态CO 2容积,待其达到样本室容积的80%时,关闭进气阀,停止注入,经1~2h可完成CO2置换。⑤加热:在达到临界状态(31℃)后,将温度再升高10℃,持续5~10min,使液态CO2气化。⑥排气:打开排气阀,以1.0~1.5L/min的速度逐渐排出气体,样品即可完全干燥。

(2)冰冻干燥法:指冷冻条件下使样品中水分直接由冰升华,或经过某种升华介质由固相升华,以达到干燥的目的。这里以乙醇干燥法为例,说明该方法的操作步骤。①样品常规固定、脱水后浸入100%乙醇;②样品放入装满液氮的金属杯中冷冻,然后连同金属杯、液氮一起放到已用液氮预冷的真空镀膜仪的样品台上;③抽真空,使液氮、样品中的乙醇升华,需20~30min,样品即干燥;④温度升到室温后取出金属杯和样品。

(3)真空干燥法:真空干燥法是一种将已经脱水处理的样品置于真空容器进行干燥的方法,常用的有叔丁醇干燥法、乙腈干燥法、正丁醇干燥法等。现以乙腈干燥法为例,说明该方法的操作步骤。①常规方法固定、清洗。②乙腈置换:使用50%、70%、80%、90%、100%的乙腈水溶液置换,最后再一次用100%乙腈,每次15~20min。③干燥:至纯乙腈时,放入真空干燥器抽真空,乙腈和样品在真空中很快被冻结,变成冰状固体。然后继续抽真空,使冻结的乙腈升华,约30min样品可干燥。

6.导电处理(镀膜) 将样品用粘结剂(银导电胶或石墨乳胶)粘到样品墩上,待导电胶干燥后,按离子溅射镀膜或真空喷镀的方法进行表面导电处理。镀膜可提高样品的导电性和二次电子量,改善图像质量,并防止样品因受热和辐射而破坏。采用离子溅射镀膜法,可获得均匀的细颗粒薄金属镀层,使图像质量提高。

(二)游离细胞的扫描电镜样品制备

游离细胞的扫描电镜样品制备主要用于血细胞,胸腔积液、腹水细胞,卵细胞,精细胞等样本。现以红细胞为例说明游离细胞扫描电镜标本制备过程。

1.取材 取血放入1%等渗磷酸盐缓冲液,37℃温育15~20min,以恢复红细胞生理状态。胸腔积液、腹水细胞标本制备方法与此类似,但制备血小板样品,需先加枸橼酸钠或肝素抗凝。

2.预固定 加入浓度为0.25%的戊二醛,固定15min。

3.离心 注意离心力不能过大,时间也不能过长,根据细胞大小,选定离心速度。如红细胞为1000 r/min、8min;血小板为1500 r/min、10min。

4.固定 离心后弃上清液,在细胞沉淀中加入2.5%戊二醛,用吸管轻轻吹打,使细胞分散,室温固定30min。

5.清洗 由于游离细胞悬浮在体液中,固定细胞时,体液中蛋白质必然被一同固定。这些固定的蛋白质小块会附着于细胞表面,遮盖细微结构,影响观察。观察前必须将它们充分洗除。清洗还有去除固定液、将细胞团块分散为单细胞等目的。清洗时需注意以下几点。

(1)清洗不要用缓冲液,而用预先经微孔滤膜过滤去除了细菌及颗粒杂质的双蒸水。

(2)清洗时用力要适度,应多次吹打样品,一般清洗2次。

(3)每次换液吸管都应更换,以防交叉污染。

(4)离心时间不能过长,离心力也不可太大。

6.样品附着 将浓度适宜的细胞悬液滴在已铺好膜的玻片(将0.1%多聚L-赖氨酸滴在洗净的玻片上,待液滴展开后在45℃烘箱中干燥即可)上,4℃,湿润条件下放置30min,使细胞附着到膜上。

7.脱水 双蒸水振荡洗涤后,样品迅速放入丙酮,阶梯脱水,每步脱水时间5min。

8.临界点干燥、粘样、镀膜 同常规扫描电镜生物样品制备。