核酸序列分析

第六节　核酸序列分析

核酸是生命的遗传物质，遗传信息存在于4种单核苷酸（A，G，C，T/U）按不同顺序连接而成的核酸分子中，迅速准确地解读决定生命性状的密码，测定基因组的核酸序列，对于识别病原，揭示疫病变化规律是其他任何方法都无法比拟的，但它也是最烦琐和最复杂的检测技术，目前在动物检疫中尚不多采用，但正在日益变得常用。

目前应用最多的快速测序技术是Sanger等（1997）提出的双脱氧链终止法。其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成的碱基排列顺序。

一、Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序

操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP，包括放射性标记dATP，例如a³²PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板、则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，³²P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’端位置没有羟基，故不与一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列没长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

二、双脱氧测序的示例及具体操作步骤

（一）变性双链模板的制备

1.材料　Tris/葡萄糖缓冲液（20mmol/L Tris－HCl pH8.0，10mmol/L EDTA.50mmol/L葡萄糖），1% SDS，0.2mol/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiCl，冷70%乙醇和无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。

2.配制方法

（1）取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150μl Tris/萄萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5min。

（2）加入300L的1% SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15min，加入225μl 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45min，然后离心5min。

（3）将65μl上清液转移至一支新管中，加入650μ1异丙醇，混合后在室温下放置10min，离心5min后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

（4）用125μl TE（pH8.0）重新溶解DNA，加入375μ1的4mol/L LiCl，在冰浴中20min后，于4℃下离心5min。

（5）将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30min，离心5min，弃去上清液。

（6）用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5min，弃去上清液并干燥，用50μl TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

（7）取0.2g质粒DNA，并将体积调至9μl，加入1μl 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5min，加入2μl30mol/L醋酸钠（pH4.5）和8μl水。

（8）加入6μl冰冷无水乙醇，混合后在干冰／乙醇浴中放置15min，在4℃下离心5min，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5min并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

（二）延伸和终止反应

以利用T₇DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

1.材料　变性的双链DNA模板（溶解在TE缓冲液中），0.5pmol/μl寡核苷酸引物（溶解在TE中，－20℃贮存），5×测序缓冲液（200mmol/L Tris pH7.5，50mmol／L MgCl₂，－20℃贮存），0.1mol/L DTT（当月新配－20℃贮存），15mol/L的3种dNTP混合物（缺dATP），1000至1500Ci/mmol a³²PdATP（在－20℃下达4至6周），修饰的T₇DNA聚合酶，标准酶稀释溶液（20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/ml BSA，10mmol/Lβ－巯基乙醇，4℃贮存），终止混合物，甲酰胺上样缓冲液（0.2ml 0.5mol/L EDTA pH8.0，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯青，10ml甲酰胺）。

2.配制方法　取4支0.5ml离心管，标上G、A、T、C，每管加入7μl变性的双链DNA模板（分别为1μg和2μg），1μl寡核苷酸引物和2μl 5×测序缓冲液混合，65℃保温2min。在室温下冷却30min。

3.每管加入1μl 0.1mol/L DTT，2μl/l 1.5mmol/L）3种dNTP混合物，0.5μl a³²PdATP和2μl（2IU）修饰的T₇DNA多聚酶混合物，在室温下放置5min。

4.按标记每管分别加入3μl 4种ddNTP终止混合物的一种。

5.短促离心后，在37℃下保温5min。

6.加入5μl甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2min，并迅速置于冰浴上，每个样品取3μl，上样电泳。

（三）测序反应物电泳和序列读取

1.按普通聚丙烯酰胺凝胶制备方法制作梯度胶。

2.按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T种泳道上样lμl，而在C泳道上样1.5μl。

3.上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。

4.电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30min脱去尿素。

5.在60℃或80℃干燥30min，放射自显影读取序列。

三、研究进展

（一）几种快速获取模板的方法

1.单链噬菌体系统　利用克隆载体M13噬菌体浸染大肠杆菌，细菌细胞噬菌体基因组以复制型双链DAN存在，并经滚环式复制产生子代噬菌体正链DNA，同时合成有关蛋白，装配后释放到细胞外。成熟的M₁₃噬菌体含单链DNA，经克隆的筛选、抽提纯化，得到所需模板。

2.杂交质粒系统　此系统除具M13系统的功能外，还能作为表达载体直接用于DNA序列分析和基因表达研究。

3.直接利用RNA进行序列测定　在杂交质粒的多克隆位点两侧插入一段能被噬菌体RNA聚合酶识别的启动子，在噬菌体RNA聚合酶的作用下，在体外将克隆的外源双链DNA转录为单链的RNA，以RNA为模板，与引物退火后，在反转录酶（如AMV）作用下，按双脱氧链终止法步骤进行序列分析。

4.PCR技术的采用　PCR技术的出现，使序列分析用DNA模板的制备更加方便。

（1）例如用PCR法合成双链DAN片段，直接用双链进行测序。

（2）在PCR扩增时，两个引物之一的5’端生物素化，扩增后将DNA变性，通过亲和素柱，分离5’端含生物素的单链。

（3）利用不对称PCR，按1∶50匹配两引物含量，产生单链DNA。

（4）GAMTS法，在两个PCR引物之一的5’端连接噬菌体RNA聚合酶启动子序列，这样经PCR扩增产生的双链DNA片段的一端就带上了该启动子序列。然后以扩增出的双链DNA为模板，在噬菌体RNA聚合酶作用下转录出单链RNA。再以单链RNA为模板进行序列分析。

（二）采用高分辨率的凝胶电泳技术

1.采用薄胶　凝胶厚度减少到0.5mm或0.1mm，样品泳动加快，自显影时减少β粒子在凝胶中的散射，提高分辨率。

2.采用梯度胶　包括离子梯度和浓度梯度，使DNA片段泳动均匀，大小不同而又很相近的大片段更易拉开距离。

3.采用鲨鱼齿梳　使相邻泳道相互靠近，不但在显影图上更易判定相邻带的上下关系，而且可以增加每板凝胶的泳道数目。

（三）DNA序列分析自动化

1.放射自显影自动读谱仪　在电泳装置中装一个高灵敏度放射性探测仪，在电泳过程中将结果输入计算机，获得分析结果。

2.用荧光标记引物或荧光标记ddNTP　可在电泳过程中以激光扫描装置识别DNA条带，经计算机处理后得到序列分析结果。此法适宜大量样品的测序。