核酸的序列分析

DNA测序技术（DNA sequencing）始于1975年Sanger和Coulson发明的链终止法以及1977年由Maxam和Gilbert发明的化学法，经过30多年的发展，从第1代到第3代乃至第4代，测序技术获得了相当大的发展。

Sanger法的核心原理是：由于dd NTP的2′和3′都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可用来中断DNA合成反应，在4个DNA的合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的dd NTP（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图7－27）。

图7－27 基于Sanger法的DNA测序原理

第1代自动化测序技术均以Sanger法为核心技术，将ddNTP用不同颜色的荧光标记，反应产物在毛细管中进行电泳，通过激光检测，获得待测DNA的序列信息，实现了自动化测序。第1代测序技术的主要特点是测序读长可达1 000bp，准确率高达99．999％，但其有测序成本高、通量低等缺点，严重影响了其大规模应用。

第2代测序技术——大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现令DNA测序费用降到了以前的1％，使以前局限于大型测序中心进行的基因组测序能够被众多研究人员分享。第2代测序法的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记4种不同的ddNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种ddNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。第2代测序技术均需要经过文库制备（将目标DNA剪切成小片断）、锚定桥接（将单个DNA小分子结合到固相表面）、预扩增、单碱基延伸测序、数据分析多个步骤。与第1代技术相比，第2代测序技术不仅保持了高准确率，而且大大降低了测序成本并极大提高了测序速度。使用第2代SOLi D的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要1周左右。由于第2代测序技术产生的测序结果长度较短，因此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序。在对全新的基因组进行测序时还需要结合第1代测序技术。

第3代测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。第3代测序技术最大的特点为单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。以单分子实时DNA测序技术（single molecule real time，SMRT）为例，其原理仍然基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为载体进行测序反应。当DNA模板被聚合酶捕获后，4种不同荧光标记的dNTP通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间，因此统计荧光信号存在时间的长短可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信号与时间的关系图，即可测定DNA模板序列。SMRT技术具有超长读长、无需模板扩增、运行时间迅速、能直接检测表观修饰位点，以及进行RNA测序等优点，但较高的测序错误是第3代测序技术目前最大的发展障碍，因而尚需进一步完善。

（魏湲颜）

参考文献

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［2］Nelson DL，Cox MM．Lehninger Principles of Biochemistry．5th ed．New York：W．H．Freeman and company，2008，271－337．

［3］Robin Ray Gutell．Collection of small subunit（16S－and 16S－like）ribosomal RNA structures．Nucleic Acids Research，1993，21（13）：3051－3054．