多肽链的氨基酸序列分析

1953年，Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定。目前方法学得到改进后，可自动化分析蛋白质的氨基酸序列。

（1）首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数（图1－28）。

图1－28 离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分

（2）第2步测定多肽链的N－端与C－端为何种氨基酸残基。Sanger当年用二硝基氟苯与多肽链的α－氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酰衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。C－端氨基酸残基可用羧肽酶将其水解下来。

（3）第3步是把肽链水解成片段，分别进行分析。方法甚多，常用胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、溴化氰法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键，如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。

胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）羧基侧的肽键，溴化腈水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。由水解生成的肽段，可用离子交换层析或其他层析方法将其分离纯化。

（4）最后测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法。肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基末端氨基酸的游离α－氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基末端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用。依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图1－29）。

图1－29 肽的氨基酸末端测定法

如前所述，一条多肽链可被水解成若干肽段，这些肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸顺序测定。但是获得了这些数据之后，还不能得出整条多肽链的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的前后次序。一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

近年来，由于核酸研究在理论上及技术上迅猛发展，人们开始通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列。