标记类试验

第五节　标记类试验

一、免疫酶技术

免疫酶技术是继免疫荧光技术和放射免疫测定技术之后发展起来的又一种免疫标记技术。

免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合，以酶作标记物，酶对底物具有高效催化作用的原理而建立的。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体－抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的。

免疫酶技术在方法上分为两类，一类用于组织细胞中的抗原或抗体成分检测出和定位，称为免疫酶组织化学法或免疫酶染色法；另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。

（一）免疫酶染色法

标本制备后，先将内源酶抑制，然后便可进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与荧光抗体法相同，是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。免疫过氧化物酶试验是免疫酶染色法中最常用的一种。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。

1.直接法　用酶标记特异性抗体，直接检测微生物或其抗原。在含有微生物或其抗原的标本固定后，消除其中的内源性酶，用酶标记的抗体直接处理，使标本中的抗原与酶标抗体结合，然后加底物显色，进行镜检。

2.间接法　将含有微生物或其抗原的组织或细胞标本，用特异性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的抗抗体进行处理，使其形成抗原－抗体－酶标记抗抗体复合物，最后滴加底物显色，进行镜检。

间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围广。因为只要用一种酶标记一种动物的球蛋白抗体，就可以检测该种动物的任何一种抗体。此外，酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时，在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性。免疫酶染色法已在动物检疫中广泛应用。

（二）免疫酶测定法

免疫酶测定法分固相免疫酶测定法和液相免疫酶测定法两类。

1.固相免疫酶测定法是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验（ELISA）是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种。

2.液相免疫测定法　不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需载体，直接从溶液中测定结果。本法主要用于激素、抗生素等小分子半抗原的检测，微生物学上不常应用。本节将重点介绍免疫酶染色法。

3.酶结合物的制备与纯化　在免疫酶技术中，能否制备高质量的酶结合物是试验成败的关键。为获得高质量的酶标记抗体，首先要有纯度高、活性强的酶和抗体。高质量的抗体可通过提取纯化获得。目前，应用最广泛的是辣根过氧化物酶。其次有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β－D半乳糖苷酶等。用于抗体和抗原标记的酶应无毒性、分子量小、特异性和纯度高、活性强、稳定，且易结合抗体或抗原而不明显影响彼此的活性。

辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），是从植物辣根中提取的一种过氧化物酶。它是由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉构成的一种糖蛋白，含有多种同功酶，分子量约为40000，等电点在pH5.5～9.0之间。该酶在pH5～10，50℃以下最稳定，在稀溶液中易失活，在－80℃保存最佳。氰化物、重氮化合物、氟化物和硫化物等对之有抑制作用。由于铁卟啉为HRP的活性基团，在403nm波长下呈现最大的光吸收，而与酶反应无关的其他蛋白质，在275nm波长下出现一个光吸收峰，因此可用其光密度的比值来表示酶的纯度。通常用德文（Reinhoit Zahl）的缩写字母RZ表示。即酶的纯度RZ＝OD₄₀₃nm/OD₂₇₅nm，RZ越大，酶的纯度越高；RZ越小，酶的纯度越低。高质量酶的RZ应该大于3，RZ值在2.5以上方可使用。

（三）酶标记抗体的制备方法

酶标记抗体的制备方法很多，目前应用最广泛的有戊二醛法和过碘酸钠法。

1.改良过碘酸钠法　将5mg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO₄水溶液0.5ml，混匀置冰箱30min，取出加入0.16mol/L乙醇水溶液0.5ml，室温放置30min后加入含5mg纯化抗体的水溶液（或PBS）1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L，pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h（或过夜）使之结合，然后加NaBH₄溶液（5mg/ml）0.2ml，置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min；离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L pH7.4 PBS中，并对之透析过夜。次日再离心除去不溶物，即得酶－抗体结合物。加0.02mol/L pH7.4 PBS至5ml，测定后，冷冻干燥或低温保存。

2.戊二醛一步法　在1.0ml含5mg免疫球蛋白的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液（PB）中，加入12ml HRP。缓慢搅拌并逐滴加入1%戊二醛溶液0.05ml。室温下继续搅拌2h或放置3h，然后搅拌并滴加等量100%饱和硫酸铵，于4℃冰箱中静止60min，3000r/min离心沉淀30min。将沉淀物用50%饱和度硫酸铵洗涤2次，再将沉淀物溶于少量0.02mo l/L pH7.4 PBS中，再于4℃冰箱中透析24h，中间换液3次，最后测OD₄₀₃nm和OD₂₈₀nm，计算出结合物的酶含量，IgG量以及其克分子比值。

3.戊二醛二步法　取HRP 5mg溶于pH9.5 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液（CBS）中，滴入25%戊二醛0.1ml混匀，37℃水浴2h。取出后加220g/L NaCl 0.1ml，充分混匀后置4℃冰箱内10min预冷。将遇冷至4℃的无水乙醇2.4ml，于塑料离心管内颠倒混匀后立即1000r/min离心l0min，弃其上清液，将沉淀用冷至4℃的80%乙醇洗1次，将离心管倒置，使乙醇流尽（必要时用滤纸拭去）。用PBS 0.5ml溶解沉淀物，加入待标记的抗体溶液0.5ml（含IgG5～10mg）混合后4℃过夜，加入适量中性甘油后分装，－20℃保存。

4.结合物中HRP与抗体量的测定　用分光光度计上分别于280nm和403nm波长测定酶标结合物的光密度（OD），并计算出OD₄₀₃与OD₂₈₀之比值以及HRP与抗体的摩尔比。

5.结合物稀释度的测定　用酶结合物中与抗体相应的抗原直接包被聚苯乙烯反应板，采用ELISA直接法测定酶结合物效价，通常本法制备的酶结合物作1∶10000稀释时。其OD₄₉₀仍在1.0以上。

（四）免疫酶染色法的操作程序（以间接法为例）

1.染色标本的制备　用于免疫酶染色的标本有组织切片（冰冻切片、石蜡切片）、组织乳剂涂片、组织压印片以及组织培养单层细胞标本等。这些标本的制备方法与免疫荧光技术相同。

2.标本的固定　选用的固定剂应既不影响抗原的活性，又不妨碍抗体的进入，有利于抗原和抗体的结合。微生物抗原的固定剂一般应用甲醇、乙醇和丙酮，以冷条件下的固定为宜，固定时间为10～15min。

3.标本内源酶的消除　用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于有些组织和细胞内含有内源性过氧化物酶，可与标记的过氧化物酶在显色反应上发生混淆，因此必须在滴加酶结合物之前，消除内源性酶。即可用0.3%～3%的过氧化氢室温处理标本15～30min，用0.1%苯肼37℃作用1h，或用0.074%盐酸乙醇液（100ml乙醇中含0.2ml浓盐酸）。室温处理15min，再移入PBS和生理盐水中处理15min，另外，还可用1%～3% H₂O₂甲醇处理单层细胞标本和组织乳剂涂片标本，同时起到固定和消除内源酶的作用。

4.消除标本的背景染色　在免疫酶染色法中，消除背景染色是一个关键问题。背景染色有时是特异的，如病变组织的炎性浸润、组织坏死和自溶等，都可引起抗原扩散和移位，造成背景染色。然而，大量的是非特异性背景染色，主要是由于组织成分对免疫球蛋白的非特异性作用。消除的办法最好用与酶标记的同种动物的血清二抗体做预处理。如是切片标本可以3% H₂O₂作用后，再用10%卵白蛋白作用30min，还可用保温液即0.05%吐温－20和含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对细胞标本进行预处理可以达到消除背景染色的目的。

5.感作　滴加最适浓度的抗血清，在湿盒内37℃30min，使其形成抗原抗体复合物。

6.标记　用pH7.4的PBS充分泡洗标本后，滴加最适浓度的酶标记抗IgG抗体使其形成抗原－抗体－抗IgG抗体-酶复合物。

7.加底物　用PBS充分泡洗后，加3，3－二氨基联苯二胺（DAB）－H₂O₂底物溶液，避光显色15～30min。

8.检查　冲洗吹干肉眼观察或借助普通光学显微镜检查，抗原所在部位呈现棕黄色。

在上述染色过程中，第一抗体和酶标记第二抗体的最佳使用浓度应以棋盘滴定预先选择，不宜过低或过高，过低会影响检出敏感性，过高则呈现非特异性染色。

（五）注意事项

1.检验时应取健康组织用同法染色作对照，观察其是否出现非特异性反应。

2.标本片用PBS代替酶标抗体染色，观察其内源性酶是否被抑制。

3.免疫酶染色法也可应用间接法、PPA（即酶标SPA）法等。

二、免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluoresence technique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

（一）原理

免疫学的基本反应是抗原－抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成有特异性结合物而发出的荧光。

（二）方法

该技术又分直接染色法、间接染色法和抗体补体染色法。

1.直接染色法　将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是：特异性高，操作简便快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。

2.间接染色法　如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体（第二抗体）与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原－抗体－抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，其他步骤和检查抗原相同。

由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用与第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。

间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。

3.抗补体染色法　抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原－抗体－补体－抗补体抗体复合物，发出荧光。

抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原－抗体系统。因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原－抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。

除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体－抗补体法等等。

（三）荧光抗体的制备

1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯：制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，即可能获得高效价的免疫动物免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。

2.荧光色素的标记：能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC），四乙基罗达明（rhodamine B₂₀₀，RB₂₀₀）和四甲基异硫氰基罗达明（tetramethyl rhodamine isotheynate，TMRITC）。实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄一种。

（1）FITC标记：FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490～495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε－氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般最多只能标记15～20个。

直接标记法：取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC 3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4～6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G₂₅柱，以除去未结合的游离荧光素。

透析标记法：将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调到1%（w/v免疫动物），并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16～18h,取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2 PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G₂₅柱，去除游离荧光素。

（2）RB₂₀₀标记：本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB₂₀₀及五氯化磷（PCl₅）2g放乳钵中研磨5min（在毒气操作橱中），加10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB₂₀₀溶液，随加随搅拌，在0℃～4℃继续搅拌12～18h。

（3）TMRITC标记　TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为443，最大吸收光谱为550nm，呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的1/3～1/4，结合时间持续16～18h。

（4）影响标记的主要因素：温度、时间、酸碱度和标记量4个因素。温度低，标记时间长，温度高，标记时间应短。FITC 0℃～4℃以6～12h为宜，20～25℃以1～2h为宜，37℃30～45min为宜。pH值低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0～9.5最为适宜。抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20～25mg蛋白为宜。至于标记方法，各有特点，但均不能去除非特异荧光染色因素。透析法适用于小体积的标记。

3.标记抗体的纯化　抗体标记以后，应立即进行纯化处理，以消除或降低非特异性染色和特异交叉染色。其步骤如下。

标记抗体溶液

↓透析或凝胶过滤

去除游离荧光色素

（粗制荧光抗体）

↓DEAE－纤维素层析

去除过度标记的蛋白分子

（精制荧光抗体）

↓抗原交叉吸收或组织制剂吸收

去除特异交叉反应的标记抗体

（免疫纯荧光抗体）

根据免疫荧光试剂的具体用途，纯化的方法可以不同，并不是每一种荧光试剂都需经过以上全部过程。对于某些细菌诊断试剂，只要除去游离荧光素就可以，检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述处理。

（1）游离荧光素的去除：去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素，是纯化标记试剂的最基本要求，不经过这一步处理，任何免疫荧光试剂都不能应用。

半透膜透析法：利用荧光色素分子可以通过半透膜，而蛋白分子则因分子量大不能通过的原理，逐步将游离色素除去。先将标记好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内，注意使液面上留有一定空间，扎紧袋口，先用流动自来水透析5min，再转入PBS（0.01mol/L，pH7.2）或生理盐水中继续透析，外液量至少大于内液量100倍，透析应在低温（0℃～4℃）下进行，每天换液3～4次，整个透析时间需1周左右，时间过长容易造成蛋白质变性，影响荧光抗体的质量。取透析液（外液）以紫外线灯检查，若无荧光出现，即可停止透析。

凝胶过滤法：利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别，通过分子筛除去游离荧光素，一般1h以内即能完成操作，但最好与透析法结合进行。先将标记抗体溶液透析4h，除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后，再进行凝胶过滤，这样有利于保护凝胶柱，延长使用时间。凝胶柱Sephadex G₂₅和G₅₀装好后，以洗脱液（0.001mol/L或0.005mol/L PBS，pH7.0～7.2）平衡，然后加入样品，样品与柱床容积的比例1∶2以下皆可。样品全部进入柱床后，即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完全除去，同时荧光抗体可以100%回收。

（2）未标记上的和过度标记的蛋白分子的去除：去除游离荧光素后，结合物中存在的未标记的和过度标记的蛋白质，是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。常用的方法是DEAE－纤维素或DEAD－葡聚糖凝胶层析，结合物通过层析柱后，过度标记的部分（易出现非特异性）被吸附，过低标记的或未标记的部分（易降低敏感性）自由流出，从而可以得到荧光素与蛋白质结合比最适的部分。DEAD－纤维柱用PBS平衡后，柱上端放一大小合适的滤纸片，打开下口，调解流速至每分钟10～20滴，待柱上液面剩一薄层PBS时，用吸管滴加标记样品，样品进入柱床尚离一薄层时，用适量PBS冲洗管壁，然后用大量0.01mol/L，pH7.2 PBS洗脱，用20%磺基水杨酸液测试洗脱液。待蛋白出现阳性反应时即可收集，蛋白反应阴转时停止收集，该洗脱液即为纯化的标记抗体。

（3）特异交叉或额外性标记抗体的去除：某些免疫原（如病毒、组织内酶抗原）是用组织制备的，其中组织细胞成分难以完全清除，在免疫时可出现相应的抗体。为去除特异交叉或额外性标记抗体，常用与染色标本同种的同样脏器或其他脏器（如肝）的干粉吸收法进行处理。这一步处理对标记的抗体来说，损失是很大的，一般可省去这一步。

4.标记抗体的鉴定　经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体，使用前需做特异性测定、敏感性鉴定以及纯度测定后，才可正式用于荧光抗体染色。

（1）理化特性鉴定：主要有荧光色素量（F）和总蛋白量（P）的比值，这反映着标记率的高低。通过对结合物中荧光素和蛋白质含量测定，即可计算出F/P的比值。病毒抗原定位时，F/P比值以1.0～1.5为宜。

（2）染色滴度测定：以倍比稀释的荧光抗体与对应抗原标本片作系列染色，出现荧光强度最大的稀释度，即为该结合物的特异性染色滴度。同时以不含抗原的阴性对照测定非特异性染色滴度。实际应用时应取低于特异性染色滴度的稀释度高于非特异性染色滴度的稀释度。如特异性滴度为1∶64，非特异性滴度为1∶8，则用时可做1∶32稀释。

（3）染色特异性鉴定：通常以吸收试验和抑制试验鉴定其特异性。吸收试验是在荧光抗体中加入过量的对应抗原，然后以此染阳性标本，应无明显荧光。抑制试验是将标本先用未标记的抗血清作预处理，再用荧光抗体染色，特异性荧光应受到明显抑制，荧光强度降低或消失。

（四）荧光抗体染色

（1）标本的制备　染色标本的制备方法依材料类型而异，如细菌培养，感染动物的组织或血液、浓汁、粪便、尿沉渣等，可制成涂片或压印片。病变的组织器官可采用冰冻切片或低温石蜡切片。也可将生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。

（2）标本的固定　在荧光抗体试验中，染色标本的固定是个很重要的一步，其目的是防止标本脱落，除去类脂以利抗原、抗体结合和降低本底荧光。固定剂的选择和固定条件应根据被检对象而定。最常用的固定剂是丙酮和75%乙醇，其次是甲醇、甲醛、戊二醛等。固定的温度和时间按固定效果而定。一般用37℃10min，室温15min或4℃30min。某些病毒最好以冷丙酮－20℃固定60min。固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。

3.染色

（1）直接染色法：于固定后干燥的标本片上滴加适量工作浓度的荧光抗体，置湿盒内，37℃感作30min后取出。先以pH7.2 PBS冲洗，继以自来水冲洗5min左右，最后以蒸馏水冲洗，自然干燥或吹干。滴加缓冲甘油封片（无荧光甘油9份，pH7.2 PBS1份）镜检。

对照的设立

自发荧光对照：已知抗原标本加1～2滴PBS或不加，应无荧光出现。

抗原对照：已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色，应无荧光。

阻抑试验：标本滴加同种未标记抗体感作30min后，再加标记抗体，镜检应无荧光现象。

种属抗原染色：标记抗体与种属抗原标本染色，应无荧光出现。

阳性对照：标记抗体与已知抗原染色，应呈强荧光反应。

对照染色可根据条件适当选择。

（2）间接法染色：标本经固定后，于被检标本上滴加已知未标记的抗体（或抗原）置湿盒37℃感作30min；先以pH7.2 PBS冲洗，然后浸泡于3min并注意振荡；弃掉PBS，用吸水纸吸干；滴加相应的抗球蛋白荧光抗体，置湿盒37℃感作30min；以上以PBS浸洗3次，最后用蒸馏水洗1次，缓冲甘油封片后镜检。

对照染色，被检标本加抗球蛋白荧光抗体，应无荧光出现；标本先以相应正常动物的血清处理30min，水洗后再以抗球蛋白抗体染色，应无荧光出现；阳性对照已知阳性标本加相应的特异性免疫血清，然后再以抗球蛋白荧光抗体染色，应出现特异的明亮荧光。

三、酶联免疫吸附试验（ELISA）

自从1971年Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assays，ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高妨碍了其应用，但随着制备包被抗体上采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验的应用。大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，使其成为最广泛应用的检测方法之一。目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。如猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

（一）基本原理

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

（二）用于标记的酶

用于标记抗体或抗抗体的酶需具有下列特性：有高度的活性和敏感性、在室温下稳定、反应产物易于显现、能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。

1.辣根过氧化物酶（HRP）：HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：①邻苯二胺（O－phenylendiamine，OPD）。产物为橙色、可溶性、敏感性高、最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变，是目前国内ELISA中最常用的一种；②联大茴香胺（O－diarnisidine，OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；③5－氨基水杨酸（5－Amino－Salicyticacid，5－AS），产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；④邻联甲苯胺（O－Toluidine，OT），产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。

2.碱性磷酸酶：系从小牛肠黏膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶性，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃lmin水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。碱性磷酸酶的国内产品系从猪小肠黏膜提取制成，其特异性酶活性在20000单位/mg左右。

（三）抗体的酶标记方法及标记效果测定

1.标记方法　良好的酶结合物取决于两个条件，即高效价的免疫抗体和高活性酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需用纯度高、效价高与抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

酶与抗体交联，目前多以戊二醛为交联剂，其次也可用二硝基氟苯加过碘酸钠。以HRP标记抗体为例记述标记程序。

（1）戊二醛一步法（AVrameas氏法）：将5mg HRP（RZ＝3.0，活性单位200IU/μg球蛋白）溶于0.5ml PBS（pH7.2）抗体溶液中（含IgG 2.0mg），于4℃下对PBS透析过夜。透析后用PBS补足体积达1.25ml，加入10μl25%戊二醛溶液，混匀，置室温2h，于4℃对2000ml PBS透析过夜，并换液一次。将混合液用PBS加至4ml，4℃下保存，待纯化。

（2）戊二醛二步法　将10mg HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PBS（pH6.8）中，置室温过夜。对生理盐水透析或过Sephedex－G25柱一次，以去除游离的戊二醛，再用生理盐水调到1.0ml，此即为活化酶液。取1.0ml含5mg的IgG与1.0ml活化酶液混合，再加入0.1ml碳酸盐缓冲液（pH9.5），混匀后置4℃下24h。取出加入0.lml 0.2mol/L赖氨酸溶液，置室温2h，再于4℃下对PBS（pH7.2）透析过夜，待纯化。

（3）过碘酸钠法（Nakane氏法）：将4mg HRP溶于1.0ml蒸馏水中，加入新配制的0.1mol/L的过碘酸钠，置室温搅拌20min，此时溶液颜色从棕黄色变为灰绿色，如颜色不变，需添加NaIO₄溶液。于4℃对1mol/L醋酸钠－醋酸缓冲液（pH4.4）中透析过夜。将1ml含8mgIgG的生理盐水溶液加于上述酶溶液中，随即加入15μl1.0mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.5）于室温下搅拌2h。再于混合液中加入0.1ml新配制的NaBH₄或KBH₄溶液（4mg/mlH₂O），4℃下放置2h。于4℃下对PBS透析过夜。并保存4℃下待纯化。

2.酶结合物的纯化和保存

（1）纯化：酶结合物的纯化目标是除去标记物中游离的酶，降低非特异性反应，除去未标记的抗体，以提高标记物的反应强度，纯化酶结合物的方法很多，但一般常用的纯化方法有：应用50%饱和硫酸铵盐析法，即可使标记抗体与酶的单体或二聚体分子分开，但仍残留未标记的抗体。应用Sephadex G200过滤则可将标记抗体与未标记的抗体分开。

（2）保存：将纯化的酶标记物溶液，加入牛血清白蛋白（BSA）至终浓度为1%有助保存。长期保存时，则加入等体积的甘油，分装小瓶于－20℃保存即可，切忌反复冻融，最好用冷冻、干燥、真空保存于低温（4℃～8℃）。

3.酶标抗体标记效果测定　测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率的测定等。

（1）酶与抗体活性：常用的方法为琼脂免疫扩散或免疫电泳，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1d，再用蒸馏水浸泡1h，将此琼脂凝胶片浸入酶底物溶液中着色。如出现应有的显色反应，再用生理盐水浸泡仍不褪色，表示结合物既有酶活性，也有抗体活性。良好的结合物于显色后，琼扩滴度应在1∶16以上。还有另一种用系列稀释结合物的方法，直接以ELISA法进行滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可确定结合物的使用浓度。

（2）结合物的定量测定：对结合物中的酶和IgG的定量系用紫外分光光度计于OD_403nm和OD_280nm进行测定，按下列公式计算。

A.酶量（mg/ml）＝OD₄₀₃nm×0.4

B₁.IgG量（mg/ml）＝（OD₂₈₀nm－OD₄₀₃nm×0.42）×0.94×0.62

B₂.IgG量（mg/ml）＝（OD₂₈₀nm－OD₄₀₃nm×0.34）×0.62

注：B₁系采用戊二醛为交联剂标记抗体的IgG的定量；B₂为用过碘酸钠氧化法标记抗体的IgG定量。

在已知结合物中酶量和IgG量之后，按下列公式即可计算出标记抗体的摩尔比值。

据实验报告表明，用于ELISA的结合物酶量400μg/ml效果一般，500μg/ml较好，1000μg/ml效果最为理想。摩尔比值为0.7时效果一般，1.0时较好，1.5～2.0时最好。酶结合率7%时效果一般，9%～10%较好，30%以上最好。

（四）ELISA方法的基本类型、用途及操作程序

根据ELISA所用的固相载体两区分为两大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot－ELISA）。又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA等等。

1.ELISA试验的基本操作程序

（1）包被：将溶于包被缓冲液中一定浓度的抗原（或抗体），加入微量滴定板，每孔100μl，置4℃下作用12h，用PBST洗涤3次，甩干。

（2）分层加样：各孔加入与包被物相对应的试样100μl，37℃感作1～2h，同上法洗涤3次，根据试验需要可加一层、二层或更多层次的试剂，每加一层均需同上法反应、洗涤。

（3）加入酶标记物：最后一层必须加入与前一层相对应的标记抗体（或抗原）100μl也可用能与上一层相结合的其他酶标记物，如酶标SPA，37℃作用1～2h后，洗涤3次。

（4）显色：各孔加入底物溶液100μl，室温20～30min，加2M H₂SO₄ 5μl终止反应。

（5）判定：定性试验一般可用肉眼观察判定结果。定量试验结果，需用分光光度计测定光密度吸收值判定结果，但测定吸收值所用的波长则随底物而异。

2.ELISA的不同类型

（1）间接法：用于检测抗体。用抗原包被固相载体，然后加入被检血清，经孵育一定时间后，固相载体表面的抗原与对应的抗体形成复合物。经洗涤后，再加酶标抗抗体，加入底物显色。如被检血清为人、猪、兔、牛等动物时，也可用酶标SPA（PPA）代替酶标抗抗体，称为PPA－ELISA。

（2）双抗体法：用于检测大分子抗原。用纯化的特异性抗体包被固相载体，加入待检抗原溶液后，洗涤除去多余的抗原，再加和酶标记的特异性抗体，孵育一定时间后，洗涤，除去多余的酶标记抗体结合物，最后加入底物显色。经酶催化后产生有色物的量与溶液中的抗原成正比。

（3）双夹心法：既可用于检测大分子抗原，也可用于检测抗体。双夹心法需制备与待测抗原不同源的第一抗体（Abl）和针对Abl用不同种动物制备的抗抗体（Ab2）。其操作程序为：将抗体Abl包被于固相载体上，洗涤未吸附的Abl，加入待测抗原（Ag），使之与致敏固相载体作用，洗去未起反应的抗原，加入Ab2，使之与固相载体上的抗原与抗体复合物结合，洗涤后加入酶标记的抗Ab2抗体（Ab3），使之结合在Ab2上。结果形成Abl－Ag－Ab2－Ab3－HRP结合物。洗涤后加底物显色，呈色反应的深浅与标本中的抗原量呈正比。

（4）竞争法：用于检测小分子抗原及半抗原。操作时分试验组和对照组作平行试验。

试验组：用特异性抗体包被固相载体，洗涤后加入含待测抗原溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育。对照组，即在包被抗体的固相载体上仅加酶标抗原，用PBS替代待测抗原。洗涤后加入酶底物显色。对照应显色，可根据颜色变浅的程序，估测待检抗原含量。

3.结果分析　定性试验可用肉眼观察依据反应颜色的深浅判定结果，呈橙色或黄色者判为阳性，浅黄接近无色或与对照无明显差异者判为阴性。定量试验用分光光度计分析测试出的光密度吸收值：①超过预试验规定吸收值的被检样本均属阳性，此规定的吸收值是根据事先测定大量阴性样本所取得的，是阴性样本的均值加两个标准差。②以终点滴度表示，将被检样本作系列稀释，最高稀释度仍出现阳性反应（即吸收值仍大于规定的吸收值时），则该稀释度为被检样本的滴度。③以P/N比值表示。求出该被检样本的吸收值与一组阴性样本吸收值的比值，P/N比值大于2或3倍，即判为阳性。

4.斑点ELISA（Dot－ELSIA）斑点ELISA是近年创建的一项免疫酶新技术，此项技术既保留了常规ELSIA的优点，又弥补了抗原或抗体对载体吸附不牢的缺点，它具有敏感性、特异性强，被检样品的用量少，节省材料，不需特殊仪器，便于肉眼判定结果和长期保存等优点。因此，现在被广泛应用于动物传染病抗原、抗体的检测。

Dot－ELIS的基本原理是以纤维素膜（如硝酸纤维素膜或混合纤维素、脂微孔滤膜，孔径0.2～0.4min）为固相载体，首先将抗原或抗体吸附在纤维膜的表面，通过与相应的抗体或抗原和酶标记抗体的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合上的酶催化底物使其水解后氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过出现斑点与否和色泽深浅进行判定。

（1）操作方法：①纤维素膜的处理及抗原包被，将纤维素膜用蒸馏水浸湿，待膜近于干燥时进行点样（抗原），每个样品加样10～20μl，于60℃～70℃烘干（或室温自然干燥），然后用洗液漂洗3次，最后用滤纸吸干。②加被检血清于37℃湿盒中作用30～40min，漂洗方法同上。③加酶标抗体，37℃湿盒中作用了30～40min，漂洗。④显色，加入新配制的底物溶液，感作15min，漂洗，加2% H₂S0₄终止反应，将膜晾干。

（2）结果判定：根据有无斑点及形成颜色深浅依次判为“＋＋＋＋”、“＋＋＋”、“＋＋”、“＋”和“－”。不形成斑点的判为阴性，实验时应设阴、阳性对照。