血清的稀释原则和方法

第一节　凝集类试验

某些微生物颗粒性抗原的悬液或表面覆盖有抗原的颗粒状物质，与含有相应的特异性抗体血清或红细胞混合，在一定条件下结合，凝集成肉眼可见的凝集物，这种现象称为凝集（agglutination）或直接凝集（direct agglutination）。凝集中的抗原称为凝集原（agglutinogen），对应物抗体称为凝集素（agglutinin）。凝集反应是早期建立起来的四个古典的血清学方法（凝集反应、沉淀反应、补体结合反应和中和反应）之一，在微生物学和传染病诊断中有广泛的应用。按凝集素的不同，分为普通凝集和红细胞凝集；普通凝集按操作方法又分为试管法、玻板法、玻片法和微量法等。

普通凝集反应用于测定血清中抗体含量时，将血清连续稀释（一般用倍比稀释）后，加定量的抗原；测抗原含量时，将抗原连续稀释加定量的抗体。抗原抗体反应时，出现明显反应终点的抗血清或抗原制剂的最高稀释度称为效价或滴度（titer）。红细胞凝集反应又分为红细胞凝集试验和红细胞凝集抑制试验。

一、普通凝集试验

（一）试管凝集试验

试管凝集试验是一种定量试验。用已知抗原测定受检血清中有无某种抗体及其滴度，以诊断传染病或作流行病学调查。常用于诊断布氏杆菌病和马副伤寒性流产等。现以布氏杆菌病的试管凝集反应为例说明。

1.材料准备

（1）抗原：由国家批准生产单位生产供应。本抗原是将布氏杆菌死菌体悬浮于0.5%石炭酸生理盐水中制成。我国的抗原是用国际标准阳性血清标定制成的，抗原的1∶20稀释液对国际标准阳性血清凝集价恰为1∶1000“＋＋”。

（2）被检血清：按常规的采血技术对被检动物采血并分离血清。被检血清必须新鲜无明显蛋白凝固，无溶血现象和腐败气味。加入防腐剂的血清自采血之日起，最迟于15日内检验。

（3）阳性血清和阴性血清：由国家批准生产单位生产供应。

（4）试验用稀释液：0.5%石炭酸生理盐水：化学纯石炭酸5g和化学纯氯化钠8.5g，加蒸馏水到1000ml，经高压灭菌后备用；10%浓盐水：化学纯氯化钠100g加蒸馏水1000ml，经高压灭菌后备用。检查羊血清时，用10%浓盐水作为稀释液。

2.操作方法及步骤

（1）血清的稀释原则和方法：被检血清的稀释度，牛、马和骆驼用1∶50、1∶100、1∶200和1∶400四个稀释度；猪、山羊、绵羊和狗用1∶25、1∶50、1∶100和1∶200四个稀释度。大规模检疫时也可只用前两个稀释度。血清稀释方法如下（以猪羊为例）。

每份血清用5支小试管（口径8～10mm）立于试管架上，第一管加入2.3ml石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四和第五管各加入0.5ml。用1ml吸管吸取被检血清0.2ml，加人第一管中，混合均匀后，以该吸管吸取混合液，分别加入第二管和第三管，每管0.5ml。以该吸管将第三管的混合液混匀吸取0.5ml加入第四管混匀后，又从第四管吸0.5ml加入第五管，第五管混匀后弃去0.5ml。

（2）加入抗原：以0.5%石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释（如果血清用10%浓盐水稀释，抗原原液亦需用10%的盐水稀释），然后加入上述各管（第一管不加，留作血清蛋白凝集对照），每管0.5ml，振摇均匀。加入抗原后，第二管至第五管各管混合液的容积均为1ml，血清稀释度从第二管起依次为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。

牛、马和骆驼血清稀释和加抗原法与上述一致，不同的是，第一管加2.4ml 0.5%石炭酸生理盐水和0.1ml受检血清。

（3）实验的对照系统：每次试验至少需作3种对照（各1份）。

阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

阳性血清对照：阳性血清对照需稀释到其应用的滴度，加抗原的方法与受检血清相同。

抗原对照：加1∶20抗原稀释液0.5ml于试管中，再加0.5ml上述试验用盐水。

（4）比浊管的制作：每次试验需配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据。

表7－1　比浊管的配制方法

全部试管经充分振荡后置37℃～38℃恒温箱中培养22～24h（或置37℃～38℃温箱中感作4～10h，再置室温18～24h，总计为28h），判定结果。

3.判定标准　根据反应的有无及其强度进行判定，以各管中上层液体的清亮度记录凝集反应的强度（凝集价），特别是50%清亮度（即“＋＋”的凝集）对判定结果关系很大，需用比浊管对照判定，并以－、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋记录结果。

－：细菌不被凝集，液体混浊、无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，出现圆点状沉淀，振荡时复呈均匀混浊状态。

＋：25%菌体凝集，液体透明不明显（25%清亮），管底有少许不明显的伞状物。

＋＋：50%菌体凝集，液体中等混浊（50%清亮），管底有中等量的伞状沉淀，呈小絮片状。

＋＋＋：75%菌体凝集，液体几乎透明（75%清亮），管底有明显的伞状沉淀，振荡时呈小或大絮片状。

＋＋＋＋：100%菌体凝集，液体完全透明（100%清亮），管底出现大片的伞状沉淀，振荡时呈大絮片状，但可打碎成小絮片状。

出现＋＋以上凝集的血清最高稀释度即为该血清的凝集价。

4.结果判定　牛、马、骆驼血清在l∶100稀释达＋＋或以上凝集而猪、羊血清在1∶50稀释达＋＋或以上凝集时，判为阳性反应；牛、马、骆驼1∶50稀释，猪、羊1∶25稀释呈＋＋及以上凝集时判为疑似反应，需再作一次检查。如仍为疑似反应时，而该畜群既无本病临床病例，又无流行病学证明，几次检查从未出现过阳性反应动物，可终判为阴性。

（二）定量玻板凝集试验（以布氏杆菌病为例）

1.试验材料

（1）抗原：由国家批准生产单位生产供应，按说明书使用。

（2）受检血清：处理方法与上一实验相似，但在试验前需置于室温使其温度达至20℃左右。

（3）阴、阳性血清：由国家批准生产单位生产供应。

2.操作方法　取洁净玻璃板一块，用玻璃铅笔划成约4cm2小格并注明受检血清号码，每一血清用4格。用0.2ml吸管吸取血清，按0.08ml、0.04ml、0.02ml和0.01ml加入4小格内，每一检样需换1只吸管。每格滴加0.03ml平板抗原，用牙签或火柴梗自血清量最少的一格开始，依次向前搅拌混合完毕后，将玻璃板置凝集反应箱上，温度不得超过37℃，于3～5min内判定结果。每次试验用1～2份已知阴、阳性血清作对照反应。

3.判定标准及结果判定

－：无凝集现象，液体均匀混浊。

＋：25%菌体凝集，仅可勉强看到粒状物，液体混浊。

＋＋：50%菌体凝集，有可见凝集块，液体不甚透明。

＋＋＋：75%菌体凝集，有明显凝集块，液体几乎完全透明。

＋＋＋＋：100%菌体凝集，出现大的凝集片或粒状物，液体完全透明。

牛、马、骆驼血清0.02ml呈＋＋或以上凝集，而猪、羊血清0.04ml呈＋＋或以上凝集，判为阳性；牛、马、骆驼0.04ml，猪、羊0.08ml呈＋＋凝集时判为疑似。复检的要求和终判标准同试管法。

（三）定性玻片凝集试验

定性玻片凝集试验，既可用于布氏杆菌病等抗体检测，又可用于沙门氏菌（如禽白痢）等细菌鉴定。

1.布氏杆菌病抗体检测　取布氏杆菌虎红平板试验抗原与被检血清各0.03ml，于载玻片上充分混合，于4min内直接判定结果，产生任何程度的凝集均为阳性，完全不凝集者为阴性。

2.沙门氏菌鉴定　于洁净的载玻片上滴加1滴沙门氏菌因子血清，再用铂金耳钩取待鉴定细菌培养物适量，置于载玻片上的因子血清液滴中，混合均匀后观察结果。同时于载玻片另一端滴加1滴生理盐水，同样钩取该细菌培养物混匀于其中。如在1～3min内，作为对照的生理盐水滴仍呈均匀混浊状态，而因子血清滴的细菌被凝成明显可见的絮片或粒状物，液体变为透明，则即证明被检查的细菌培养物与已知的因子血清相同。

3.鸡呼吸道支原体病全血凝集试验　在载玻片上滴加2滴抗原，再加1滴被检鸡的新鲜血液，混合后轻轻摇动玻片，1～2min后判定结果：

－：血滴不出现凝块或颗粒，仅在液体边缘出现紫色色带。

±：血滴边缘有明显的颗粒状凝集，或在2min以后出现凝集颗粒。

＋：2min内出现凝集颗粒。

＋＋：2min内出现比较明显的凝集颗粒或小凝块。

＋＋＋：2min内出现较大的凝块。

＋＋＋＋：2min内出现明显大凝块。

按＋＋以上的反应强度，判为阳性。

（四）微量凝集试验

微量凝集试验是一种简便的定量试验，尤其是进行大规模的流行病学调查，更为适用。选用U形或V形96孔微量反应板，以稀释棒将待检血清在反应板上作系列稀释，随后滴加抗原液，振荡混合后静置4～5h判定，以出现＋＋的最高血清稀释度为微量凝集试验滴度。

（五）注意事项

凝集反应是抗原与抗体反应，受许多因素的影响，试验中应注意如下事项。

1.防止被检血清冻结和受热，以免影响凝集价。

2.试管凝集反应时，凝集价高的血清在最初一两管往往由于抗体过剩而抑制凝集，即前带现象。

3.试管凝集试验，根据抗原种类不同反应条件略有差异，如肠道细菌的H抗原通常用52℃水浴2h，布氏杆菌凝集反应有时用37℃24h判定结果。

4.某些细菌（如R型细菌）当制成细菌悬液时很不稳定，在没有特异性抗体下，亦可发生凝集，谓之自凝。某些理化因素亦可引起非特异性凝集，pH值降至3.0以下时，即可引起抗原悬液的自凝，称为酸凝集。因此，试验时必须设置阳性血清、阴性血清和抗原等对照。

5.玻板凝集、玻片凝集试验应当在20℃以上室温条件下进行。

6.试验中所用试管、吸管、玻板、玻片等必须清洁。

二、血凝和血凝抑制试验

某些病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（hemagglutination，HA），也称直接血凝反应。当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（hemagglutination ingibition，HI）反应，也称血凝抑制反应。

血凝的原理因不同病毒而有所不同，如痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。

病毒的血凝现象大致可以分为3种类型。

可逆转型：血凝素与病毒颗粒易分开，经超速离心后，病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后，可再与该血凝素发生凝集，如天花、鼠疫等。

不可逆转型：血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度（37℃）下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N－乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力，如流感病毒、鸡新城疫病毒等。

凝集条件严格型：有些病毒及其血凝集红细胞的条件很严格，不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即使对同种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集性能亦有差异。如流行性乙型脑炎对公鹅的红细胞凝集性能比对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好，除此之外，病毒颗粒或其血凝素凝血时对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均很严格。

血凝和血凝抑制试验有常量和微量法，它们除了用量和用具有所不同之外，其他如试验方法、程序、参与要素及其浓度、pH值、作用时间、温度和判定等都一样。常量法各要素用量为0.25ml，在5×10孔的血凝板上进行。微量法各要素用量为25μl，在96孔V形微量血凝板上进行，微量法省时、省料、高效。目前为各国广泛使用。

（一）材料的准备

1.器材　5×10孔血凝板、96孔V形微量血凝板，微量加样器、各种规格的吸管、移液器及吸头等。

2.各种溶液的配制

（1）红细胞保存液（阿氏液）的配制：取氯化钠4.2g，枸橼酸钠8.0g，枸橼酸0.55g，葡萄糖20.5g，加无离子水至1000ml，经121℃高压灭菌15min，置4℃保存备用。

（2）血凝素（病毒抗原）稀释液（0.4% pH 9.0 BABS）的配制：因血凝素的不同，所需稀释液也不相同。如新城疫血凝素用生理盐水，而流乙脑炎血凝素则需用0.4% pH 9.0 BABS稀释液。

①0.4% pH 9.0 BABS母液的配制

0.5mol/L硼酸溶液　硼酸30g，加无离子水至1000ml，溶解后备用。

1.0mol/L氢氧化钠溶液　氢氧化钠40g，加无离子水至1000ml，溶解置3d后使用。

1.6mol/L氯化钠溶液　氯化钠87.7g，加无离子水至1000ml经121℃高压灭菌15min后置4℃备用。

②硼酸氢氧化钠盐溶液（pH 9.0 BHS）的配制：取0.5mol/L硼酸溶液100ml，1.0mol/L氢氧化钠溶液24ml，1.6mol/L氯化钠溶液80ml，加无离子水至1000ml，充分混匀后调pH值至9.0。

③0.4% pH9.0BABS使用液的配制（现用现配）：取pH9.0 BHS液100ml，牛血清白蛋白0.4g，充分溶解后使用。

（3）25%白陶土溶液的配制　取白陶土25g置离心瓶中，加适量1M盐酸溶液混匀，2000r/min离心10min，弃上清液，再加1N盐酸溶液搅匀，如上离心洗涤3次。沉淀白陶土用0.85%生理盐水或PBS100ml配成25%溶液（呈糊状），然后用5M的氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，121℃高压灭菌后，置4℃保存备用，保存期不得超过4个月。

（4）不同pH值的红细胞稀释液的配制　不同病毒对稀释红细胞用缓冲液的pH值均有不同要求，如流乙脑炎病毒要求红细胞在pH值5.8～6.6的PBS液中才能凝集。因此每次试验必须根据对象病毒而选择缓冲液适当的pH值。母液的配制方法如下。

甲液：磷酸二氢钠（Na₂HPO₄·12H₂O）35.8g，氯化钠4.4g，加无离子水至500ml，经121℃高压灭菌15min后置4℃保存备用。

乙液：磷酸氢二钠（NaH₂PO₄·2H₂O）15.6g，氯化钠4.4g，加无离子水至500ml，121℃高压灭菌15min，置4℃保存备用。

表7－2　不同pH值的PBS使用液的配制表

3.霍乱弧菌滤液的制备：

将稻叶型霍乱弧菌接种于牛肉汤（新鲜牛肉浸汁液100ml，氯化钠0.5g，蛋白胨2g，调pH值至6.9，分装试管，每管8～10ml，121℃20min高压灭菌，37℃培养12h），取此培养液接种于牛肉汤琼脂（在牛肉汤基础上多含1%琼脂），每平皿3滴，用L形玻棒于琼脂面上转匀，置37℃培养12h（琼脂面向上，勿倒置）取出，选无污染生长好的平皿，用L形玻棒去掉面上菌苔，将琼脂部分移到有两层纱布的漏斗中，漏斗下有三角瓶。用长镊子将琼脂中的水分挤出。将此液经4000r/min离心15min，取上清用蔡氏滤器EK滤板除菌。滤液经杂检确认无菌后向滤液中加入1/000的硫柳汞达，保存于4℃冰箱备用。操作时注意无菌、安全。

4.血凝素　痘类病毒的血凝素是与病毒颗粒分开的，而其他绝大多数的血凝素是与病毒颗粒相关联的。因此，血凝素的获得通常将病毒感染鸡的尿囊液或细胞培养液或用生理盐水稀释患病动物的粪便或脏器匀浆等经离心沉淀取得的上清液均可做血凝素。如流感病毒、新城疫病毒等通常用收获的感染鸡胚的尿囊液经3000r/min离心15min，取上清液即为血凝素，乙脑病毒是从人工感染的鼠脑中提取血凝素，猪血凝性脑炎病毒可用细胞培养的离心上清液做凝集素，犬细小病毒和犊牛腹泻冠状病毒均可用患畜的粪便，用生理盐水稀释（1∶10），兔出血症病毒通常用病死兔肝1∶10匀浆后离心的上清液也可用于血凝试验做血凝素。

5.红细胞悬液　根据病毒血凝特性选用适宜红细胞。如流感病毒、新城疫病毒等黏病毒和副黏病毒通常用鸡红细胞，乙脑病毒用鹅红细胞，细小病毒用猪红细胞，冠状病毒用小鼠红细胞，兔出血症病毒用人红细胞。采血时按常规尽量做到洁净无菌纱布过滤至离心管内，2000r/min离心5min，弃上清液，加5～10倍生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心5min，最后一次2000r/min离心10min，弃上清，取沉积红细胞，用适宜pH值的PBS液配成1%红细胞悬液。

（二）血凝试验

可在5×10大孔塑料板或96孔微量滴定板上进行，大孔板的操作方法如下。

1.血凝素效价测定各孔加生理盐水0.25ml。吸取血凝素0.25ml加于第1孔，混合3次后吸0.25ml加于第2孔，依次倍比稀释至第9孔，弃0.25ml，第10孔不加血凝素，作为生理盐水对照。然后每孔各加1%红细胞悬液0.25ml，混匀后，放置室温，经30、45和60min各观察结果一次。

试验也可用微量法进行，其操作步骤同大孔塑料板法，但用标准滴管稀释，每种成分25μl全量为75μl。

2.结果判定　以血凝素出现“＋＋”以上最大稀释度为该血凝素的血凝价。

＋＋＋＋：红细胞凝集成颗粒，细胞周围液体清晰。

＋＋＋：红细胞凝集成颗粒，但比上者小，周围液体清晰。

＋＋：红细胞凝集成颗粒，周围液体稍有混浊。

＋：红细胞呈小颗粒状凝集，周围液体混浊。

－：红细胞不凝集，成均质状态，下沉于塑料板底部。

（三）血凝抑制试验

1. 4个单位血凝素的制备　依血凝试验滴定的血凝价，按血凝价乘1/4，即为4个单位血凝素的稀释度，如血凝价为512，则512×1/4＝128即为4个单位。

2.被检血清的处理　因被检血清常常含有非特异性血凝物质和血凝抑制物质，故试验前需对待检血清作适当处理，非特异性血凝物质通常用红细胞吸收法，而非特异性血凝抑制物质一般用胰酶或过碘酸钾处理，也可用白陶土吸收。

（1）红细胞吸收法　取0.1ml被检血清加0.4ml 2%红细胞悬液，37℃作用30min后，离心去除红细胞，即成5×稀释血清。

（2）胰酶处理法：取0.2ml血清，加入0.2ml 0.4%胰酶，56℃作用30min，再加0.8ml生理盐水，即成1∶5稀释的血清。

（3）白陶土吸收法：取0.1ml受检血清加25%白陶土溶液0.4ml，振摇混匀，置37℃作用30min，离心除去白陶土即成1∶5稀释血清。

（4）霍乱弧菌滤液处理：1份血清加4份霍乱弧菌滤液，37℃水浴过夜，再用56℃水浴加热50min，经处理的血清最终稀释度为l∶5。

用于新城疫血凝抑制试验的血清不必进行上述处理。

3.试验方法

按表7－3将被检血清在5×10大孔板上进行倍比稀释，每份血清用1～8孔，第1孔的稀释倍数应为1∶5，如血清未经处理，则于第1孔先加0.4ml生理盐水然后加入0.1ml被检血清，混合成1∶5稀释，随后依次作倍比稀释，再依次加入4个单位血凝素和1%红细胞悬液各0.25ml，第9孔不加血清为血凝素对照，第10孔不加血清和血凝素为盐水对照。

表7－3　血凝抑制试验操作术式表

微量血凝抑制试验操作程序与5×10大板法相同，各孔以滴计量（约25μl），未经处理血清，第1孔为1滴血清加1滴生理盐水，起始稀释为2×，稀释至第10孔为1024×。11、12孔为血凝素，盐水对照。

另取一试验板或利用上述试验中剩余一排孔按表7－4稀释作血凝素效价校正。

表7－4　血凝素效价校正

4.结果判定

以能完全抑制的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制价，从表7-3可见其血凝抑制价为80×。但尚需与血凝素校正试验的结果比较或许相应提高或降低该血清的血凝抑制价。如果1单位和0.5单位血凝结果为＋＋＋＋和＋＋时，表明血凝素抗原用量高了一个滴度，则该血凝价亦应提高一个滴度，为160×。反之，如1单位和0.5单位为＋、－时，则表明血凝素低了一个滴度，血凝抑制价也应下降一个滴度，应为40×。

（四）血凝和血凝抑制试验的应用

直接血凝试验主要用于血库中红细胞抗原的分型、病毒抗原的鉴定等。血凝抑制试验主要用来测定血清中抗体的滴度、病毒的鉴定、监测病毒抗原的变异、流行病学调查、动物群体疫情的监测等。

（五）影响血凝和血凝抑制试验的因素

实验室使用的玻璃器材及血凝板均要洁净，一旦出现红细胞变色和污染就不得使用；红细胞有动物的种类及个体差异，因此同批实验应使用同批红细胞，病毒及其血凝素如保存不当，或者反复多次冻融也会影响试验结果；血清中非特异性抑制因子会影响实验结果，故试验前一定要用白陶土或胰酶等处理。血清在加温或保存过程中一旦出现沉淀也容易引起非特异性凝集，这可用红细胞吸收或通过离心来除去；如滴定双血清，抗原分析或比较动物群体抗体水平时应安排在同一次试验进行，各参与要素和器具都应使用同一批次，以免材料的不同而影响实验结果；判定结果一定要在规定的时间观察，每次试验应在一定的温度下进行，如流感病毒在37℃时会从细胞表面释放出来，因此，炎热的夏天最好在4℃下观察结果；试验时加量要准确，才能保证实验结果的正确性和重复性。

三、间接血凝试验和反向间接血凝试验

凝集反应中抗体球蛋白分子与其特异的抗原相遇时，在一定的条件下，便可形成抗原抗体的复合物，由于这种复合物分子很小，如果抗原抗体的含量过少时，形不成肉眼可见的凝集。若设法将抗原结合或吸附到比其体积大千万倍的红细胞表面上，就大大地提高了凝集的敏感性。于是人们将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理后，使得多糖抗原或蛋白质抗原被红细胞表面的受体结合或吸附，这种被抗原致敏的红细胞与相应的抗体相遇，经过一定时间后出现的血凝现象称为间接血凝反应。同样，如果抗球蛋白致敏红细胞上，也能与相应的抗原在一定的条件下起凝集反应，这称为反向间接血凝试验。在与致敏红细胞的抗原相应的抗体液中，先加入相应的特异性抗原，在一定的条件下，经过一定的时间后再加入这种抗原致敏的红细胞，由于抗原先和特异性抗体结合，这种抗原致敏的红细胞就不能与抗体起反应，呈现血凝抑制现象，这叫间接血凝抑制试验。

一般抗原致敏红细胞比较容易，而用抗体致敏红细胞比较困难，主要原因是抗血清中蛋白质的成分很复杂，其中除了具有抗体活性的免疫球蛋白之外，还有非抗体活性的免疫球蛋白，这两种免疫球蛋白很难分开，而且这两种免疫球蛋白均能同时结合或吸附在红细胞表面，一旦非抗体活性免疫球蛋白在红细胞表面达到一定数量时，致敏的红细胞就不能再与相应的抗原形成可见的凝集。因此，一般实验室均用抗原来致敏红细胞。

（一）材料准备和处理

1.器材　微量振荡器，25μl连续加液器和25μl移液器等实验室常用器械。

2.红细胞悬液　很多动物的红细胞，如绵羊、家兔、鸡、鸽子、马、猴子及人的O型血都可用作为间接血凝试验的红细胞载体，实验室多选用绵羊红细胞。选择健康的绵羊，自颈静脉无菌采血，将其注入盛有4倍绵羊血量的阿氏液的三角烧瓶内，不时摇动3～5min，置4℃过夜，次日将保存在阿氏液内的红细胞液经灭菌纱布过滤后用生理盐水洗3～4次，每次2000r/min离心5min，最后一次2000r／min离心10min，用生理盐水配成0.5%～1%的红细胞悬液，4℃保存，备用期一周。

3.红细胞的醛化

（1）醛化原则：无论是致敏的或未致敏的新鲜红细胞保存期很短，临时致敏也不方便，且不同批次或不同动物个体的差异，造成对系统研究工作前后结果不一，影响诊断，故目前都采用醛化红细胞。醛化的方法随醛种类的不同（有甲醛、戊二醛及丙酮醛）而异，但醛化的原则是一样的，如醛化之前必须充分洗涤红细胞，除净红细胞表面的血浆蛋白；加醛固定过程中红细胞最终浓度为10%；开始加入浓度不宜过浓；醛化作用温度要低，否则红细胞容易变异，在整个醛化过程中要不时地振摇，使醛类与红细胞充分均匀地接触。目前国内都采用戊二醛，因为戊二醛醛化过程简单，在短时期即可完成，且致敏的效果也比较好。

（2）醛化方法：红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4%的悬液，在冰浴的条件下加入2.5%的戊二醛，边加边摇，使最终浓度为0.4%（即100ml 4%的红细胞悬液内加入16ml2.5%的戊二醛），在4℃固定1h，摇匀后用生理盐水洗涤4～5次，最后用生理盐水配成10%的红细胞悬液。加1∶10000（终浓度）NaN₃，4℃保存备用。

（3）再醛化（双醛化法）：在第二步用生理盐水洗涤单醛化的红细胞后，将红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4%的悬液，再用丙酮醛（最终浓度1.6%）作第二次醛化，4℃固定17h，不断摇晃，洗涤后配成4%的红细胞悬液，加入1∶10000（最终浓度）NaN₃，4℃保存备用。

4.鞣酸处理红细胞　为了进一步提高间接血凝敏感性，经醛化后的红细胞必须再经鞣酸处理，因为鞣酸本身也是一种血凝素，高浓度时会使红细胞凝集，低浓度时使红细胞处于稳定状态，故经适当浓度的鞣酸处理后，致敏的红细胞能使实验的敏感性大大提高，其操作如下：称取适量优质鞣酸用pH7.2的PBS液配成1∶20000的溶液，必须现用现配；将4℃保存的醛化红细胞，用生理盐水洗2～3次，并用生理盐水配成2.5%的红细胞悬液，与等量的1∶20000的鞣酸混合，置于37℃水浴10～15min，取出用pH7.2的PBS液洗1次，再用pH7.2的PBS液配成2.5%的红细胞悬液。

5.鞣酸化红细胞的致敏　将抗原（或抗体）结合或吸附于红细胞表面称为致敏，已结合或吸附抗原（或抗体）的红细胞称为致敏红细胞。致敏物质可为糖类或蛋白质。多糖抗原比较容易致敏，可吸附于未经处理的红细胞表面。而蛋白质抗原或抗体需要有别的成分参与方能致敏红细胞，如常用的鞣酸法、联苯胺法、金属离子法等。

（1）致敏红细胞的最适抗原或抗体用量的测定：致敏红细胞的抗原或抗体的用量过低就不能得到凝集的最高效价，而过高亦不能再提高凝集反应的敏感性，因此在正式试验之前都必须测试致敏用的抗原抗体的最适用量。方法是将抗原或抗体作倍比稀释，分别致敏红细胞后，再与相应的抗血清或抗原作血凝反应，出现最高血凝效价的最少抗原（或抗体）称为一个致敏单位，正式实验使用两个致敏单位即可。

（2）致敏方法：取两个单位的致敏抗原（或抗体）lml，加pH7.2的PBS液4ml，再与2.5%鞣化红细胞混合均匀后于37℃作用30min，经2000r/min离心5min，沉淀的红细胞用含有1%已灭能的健康兔血清的pH7.2的PBS液配成2%的致敏红细胞悬液，一般病毒抗原致敏的红细胞应立即使用，4℃保存也不超过48h，为了延长致敏红细胞的保存期，将洗涤后的致敏红细胞用含4%健康兔血清的PBS pH7.2液配成10%的致敏悬液加0.01%的硫柳汞摇匀，分装于灭菌的安瓿，1支1ml，低温真空干燥，冻干以后的致敏红细胞其凝集效价不变，亦无自凝现象，在4～6℃可保存6个月，冻干致敏红细胞使用时，每支加pH7.2的PBS液5ml摇匀后使用。

6.兔血清稀释液　取5～7只健康的成年家兔，心脏采血，分离血清，所得各血清经检查无菌后混合，56℃灭能30min，分装后置－20℃保存，可长期使用，使用时以pH7.2的PBS稀释液配成1%的兔血清。现用现配。

7.受检血清：按常规方法采集、分离的血清，经56℃灭能30min备用。

（二）间接血凝试验方法

1.取洁净的96孔V形血凝反应板，在其长端顺序编号，每一检验样品用两排，每排8孔，用连续加液器，每孔加入含1%兔血清的pH7.2的PBS稀释液25μl。取25μl被检血清，加人第一孔内混合后；用微量自动稀释器或稀释棒，插入第1孔内，充分稀释后蘸取25μl移至第2孔，充分稀释后蘸取25μl至第3孔，依次倍比稀释至第7孔，混合后弃掉25μl，最后1孔不加检样为空白对照，每一检样按同法稀释两排。每一检样的第1排孔滴加1%的致敏红细胞悬液25μl，为测定排；第二排各孔滴加1%未致敏红细胞各25μl，为对照排。置微型振荡器上振荡混合2min，再置室温2h，待空白对照孔红细胞全部沉于孔底，即可判定结果。

2.结果判定　判定标准如下。

++++：100%红细胞凝集，凝集颗粒均匀地分布在整个孔底，呈薄状。

＋＋＋：75%红细胞凝集，孔底形成环状，周围有凝集颗粒，但不成膜状。

＋＋：50%红细胞凝集，孔底中心有少量红细胞沉积，周围有不均匀的分散红细胞。

＋：25%红细胞凝集，红细胞大部沉积于孔底中心，周围有少量分散红细胞。

－：为不凝集，红细胞完全沉积于孔底中心，呈小圆点状。

以凝集＋＋或以上的最大稀释倍数为该检样的血凝价。

血凝价在80×以上，测定排比对照排提高两个滴度以上，判为阳性，只高出一个滴度判为疑似，两排滴度相同判为阴性。

（三）反向间接血凝试验方法

其操作和判定与间接血凝试验一样，反向间接血凝试验仅仅是用抗体致敏红细胞来检测组织悬液或细胞培养液中的抗原。

（四）注意事项

每次试验时，应设标准阳性血清和阴性血清各两排作为对照。操作过程应避免产生气泡，如遇有气泡可用烧热针头烫掉。试验用的红细胞悬液不能冰冻保存，以免出现自凝。每一检样用一只滴管，不可交叉使用。

四、乳胶凝集试验

聚苯乙烯乳胶是大小一致的球形小颗粒，乳胶微球直径约0.8μm。在偏碱条件下，呈稳定的白色悬浮液——乳胶。乳胶颗粒对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸咐性能。利用乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原或抗体，即可用于检测相应的抗体或抗原，称为乳胶凝集反应。本法具有简便、快速、保存方便、比较准确等优点。在血清学诊断中已用于钩端螺旋体病、囊虫病、沙门氏菌病、妊娠诊断以及激素等的检测。

聚苯乙烯乳胶既有商品出售，也可自行合成，用以吸附抗原时，可以pH8.2的甘氨酸缓冲液将其制成1%乳胶，逐滴加入适当稀释的抗原液，充分混合后，置37℃30min，离心洗涤，恢复至原来1%乳胶体积。也可用以吸附抗体，制备乳胶血清。即在0.4%乳胶液25ml中，逐滴加入稀释一定倍数的抗血清1～7ml，边加边摇，当出现微颗粒时继续滴加，直至颗粒消失为止。吸附致敏后的乳胶液加入硫柳汞防腐剂至0.01%，置4℃下可保存数月至1年。乳胶液切忌冻结。

乳胶凝集反应常采用玻片法，也可用试管法。现以检测沙门氏菌抗原的乳胶凝集反应玻片法为例叙述其操作程序。

1.材料准备

（1）器材与试剂：玻板或玻片、滴管和吸管等器材；沙门氏菌A－F多价血清或各群单价血清；商品的聚苯乙烯乳胶；硼酸缓冲液（甲液：硼酸12.37g加水至1000ml；乙液：硼砂19.07g加水至1000ml，二液配好后分别高压灭菌，用时取甲液65ml加乙液35ml即成，pH8.4～8.6）。

（2）乳胶致敏：乳胶1ml加蒸馏水4ml，再加硼酸缓冲液20ml，即成25倍稀释的乳胶，滴加用生理盐水1∶20稀释的沙门氏菌诊断血清1～2ml，边加边摇，至出现微细颗粒后，继续滴加直至颗粒消失为止。致敏乳胶应符合下列条件方可使用（a.与生理盐水不出现自凝；b.与相应抗原菌株出现阳性凝集；c.与其他无共同抗原的菌株不出现凝集）。

（3）待检增菌培养物的制备：将待检样品接种于沙门氏菌增菌培养基上37℃培养24h，即可获得。

2.试验方法和结果判定　取洁净玻板或玻片，用蜡笔划成方格，记录检样编号。滴增菌培养物2～3滴于玻板的方孔内，然后于其上滴加致敏乳胶1滴，用牙签混合后轻轻摇动。于3～5min出现明显凝集颗粒者为阳性反应，根据其反应凝集程度以＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋和－记录反应结果。

五、协同凝集试验

葡萄球菌A蛋白（Staphylococal proteinA，简称SPA）是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质成分，参与多种哺乳动物IgG分子的FC片结合。SPA与IgG结合后仍保持其抗体活性。当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可互相联结引起协同凝集反应（简称COAG）。本法已广泛应用于快速检测多种细菌、病毒等颗粒抗原以及可溶性抗原。

用于COAG的标准菌株有Cowan1株和国内选育的1800株，以及对照的，不含A蛋白的Z12、Wood46株等。

COAG通常用玻板法，数分钟内即可判定结果。以猪败血链球菌为例，其检测方法如下。

1.器材与试剂　器材同乳胶凝集试验，试验用稀释液为0.1M pH7.2PBS按常规法配制。

2.SPA菌液的制备　以标准菌株Cowan1株或国内选育的1800株葡萄球菌接种于葡萄糖营养琼脂培养18h～24h，用PBS洗下菌落，洗涤2次，加0.5%甲醛PBS制成10%（v／v）菌悬液，置室温3h，离心去上清，用PBS洗2次，积压菌体恢复10%浓度，并加叠氮钠至0.1%浓度。此即SPA菌液，于4℃下可保存数月。

3.SPA菌液的致敏　取上述SPA菌液1ml，以PBS洗涤2次，将沉淀恢复至1ml，加入猪败血链球菌抗血清0.1ml，充分混合后，置37℃水浴30min，不时轻轻振动，使抗体与SPA充分结合，离心去上清，再用PBS洗2次，沉淀用含有0.1%叠氮钠的PBS制成1% SPA致敏菌液。

4.待检菌液　将猪败血链球菌接种于血清肉汤中，37℃培养过夜即得；另外接种1支猪丹毒杆菌作对照用。

5.试验方法与结果判定　取洁净玻片用蜡笔划成3格，第一格加猪败血链球菌液体培养物1滴，第二格加猪丹毒培养物1滴，第三格加空白培养基1滴，然后各加入致敏SPA菌液1滴，混合后，在0.5min之内即出现明显凝集者（＋＋＋＋或＋＋＋）为阳性，凝集颗粒小者（＋＋）为可疑，液体混浊（＋、－）为阴性。