乳糖蛋白胨培养基灭菌时间

第二节　培养基的制备

培养基的配制是疾病诊断实验室中一项重要的基础工作。配制过程的每个步骤都应精确细致，方能保证其质量的稳定可靠。因此，使用的器皿、用具必须极为清洁、大小适宜、使用方便，忌用铁或铜质器皿。同时还必须供给适宜的生长环境和细菌生长繁殖所需要的营养物质，以益于微生物的生长。所制的培养基应透明，以便于观察培养菌的培养性状。为保证配制工作的顺利进行应事先做好各项必要的准备工作。

一、原材料的准备

（一）基本营养物质

1.水：制作培养基时，一般使用天然水即可。严格要求时，应使用蒸馏水。

2.蛋白胨（peptone）：蛋白胨是由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物，是微生物培养基最主要的基础成分，其主要作用是为微生物生长提供氮源。蛋白胨在培养基中除了提供氮源外，由于其为两性化合物，故还具有缓冲作用。目前，市售的商品蛋白胨种类很多，如酪蛋白胨、肌肉蛋白胨、心肌蛋白胨、肝蛋白胨、明胶蛋白胨、血粉蛋白胨和大豆蛋白胨等。

（1）酪蛋白胨（tryptone）：酪蛋白胨是从牛奶中提取的一种营养价值很高的磷蛋白，因其氨基酸组成较齐全，特别是色氨酸的含量较高，所以它在细菌生化试验中最适宜做靛基质和糖发酵试验。但它缺乏胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸，故不适宜做硫化氢试验。适宜于培养厌氧菌、真菌、梭状芽孢杆菌及水的细菌检验和硝酸盐还原试验。常用于原生动物的培养和抑菌或杀菌剂的检测、抗生素和其他抗菌物质的检测及配制无菌试验用培养基等。酪蛋白胨是用胰蛋白酶消化的，如用乳清蛋白胰酶消化则为乳清蛋白胨或称乳蛋白水解物，因此胨含有丰富的色氨酸，故特别适用于靛基质试验、乳杆菌培养、产生色素及配制鸡胚细胞培养基。

（2）肌肉蛋白胨（meatpeptone）：肌肉蛋白胨与酪蛋白胨比较，色氨酸含量较少，硫氨基酸较多，其他氨基酸极为丰富，因此特别适合于硫化氢试验。此外，肌肉蛋白胨更适于培养副鸡嗜血杆菌、葡萄球菌、沙门菌、巴氏杆菌及组织胞浆菌等。因为它不仅含有丰富的氨基酸，而且含有更多的细菌需要的维生素和其他生长因子。培养基中使用的肌肉蛋白胨尤其是胰酶消化的蛋白胨，多数可不需再添加牛肉浸膏。

（3）心肌蛋白胨（heartpeptone）：其与肌肉蛋白胨无显著区别，但因含有丰富的促生长营养物质，故用于培养细菌生长发育比肌肉蛋白胨快而多，此胨是用胰酶消化的。

（4）肝蛋白胨（1iverpeptone）：肝含有适合于营养要求严格的细菌发育所需的氨基酸和生长因子，用肝制成的蛋白胨可用于配制支原体、厌氧菌、真菌和原虫属的培养基，此胨亦可代替培养基中的肝浸液、酵母浸膏、心肌浸液，通常是用牛肝木瓜酶消化的。

（5）明胶蛋白胨（gelatinpeptone）：此胨缺乏半胱氨酸和色氨酸，且几乎不含碳水化合物，是一种低营养价值的蛋白胨，故不适合营养要求高的细菌生长，而适用于糖发酵试验，该产品是用胰酶消化的。

（6）大豆蛋白胨（soyapeptone）：此胨含有丰富的碳水化合物和维生素，尤其是维生素B。含量较高，故适用于包括真菌在内的极广泛的细菌生长。在一般培养基上不生长的细菌（如链球菌、肺炎球菌、巴氏杆菌等）在含大豆蛋白胨的培养基上能很好地生长，其原因可能是有丰富的碳水化合物。在血平板上溶血反应较典型。但其不适用于糖发酵试验，故实际应用时几乎不单独使用，常与其他蛋白胨合用。商品大豆蛋白胨是用木瓜酶消化的。

（7）混合蛋白胨（mixedpeptone）：一般培养基使用适宜比例混合的多种蛋白胨比使用单一的蛋白胨营养齐全，培养细菌效果更好。商品混合蛋白胨的组成有的已知，有的不详。

（8）酪蛋白酸水解物（caseinhydrolysate，acid）：此类产品通常是盐酸水解物，在生产过程中用碱中和，故氯化钠含量高，为37%～38%。此水解物主要用于链球菌的毒素生产，还用于细菌生理学和细胞遗传学等基础研究，作为培养基的纯氮源。

3.浸液（infusion）：浸液是由一定量的蒸馏水作为浸出剂，将组织中可溶性成分溶于水内，该水溶液称为浸出液，简称浸液；如欲制成膏状物或粉状物，再将其浸出液在不影响有效成分的温度下浓缩成膏状，称之为浸膏；或干燥成粉末状，称之为浸出粉。浸液成分实际上就是组织除去蛋白质后的耐热水溶性部分，为保留其水溶性成分可用酶水解等方法来增加水溶性部分。组织浸液主要为微生物生长繁殖提供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生素及无机盐类等，以补充蛋白胨营养成分的不足部分。

组织浸液的品种较多，按其原料来源可分为动物组织浸液、植物组织浸液、微生物细胞浸液三类。根据实际使用效果，一般认为浸液的质量比浸膏和浸出粉为好，这可能是在加工过程中由于某些有效成分损失或被破坏所致。

（1）动物组织浸液的制备方法

①牛肉浸液（beef infusion）

成分：牛肉500g，蒸馏水1000ml。

制法：去除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉，用绞肉机绞碎，按上述比例放入适宜的容器内，搅拌均匀，置冰箱浸泡20～24h后，取出逐渐加热升温，最后煮沸1h，其间不断搅拌，用水补足蒸发量，过滤，滤液分装于玻璃瓶内，121℃30min高压灭菌，待冷却后，置冰箱保存备用。

用途：牛肉浸液为最常用的培养基基础液，广泛用于配制营养肉汤、营养琼脂、半固体等培养基。因含有碳水化合物，故不宜配制糖发酵培养基。

②鸡肉浸液（chicken meat infusion）

成分：鸡肉100g（或500g），蒸馏水1000ml。

制法：取6～10月龄的健康母鸡肉，去除脂肪、肌膜和结缔组织后，用绞肉机绞碎，按上述比例加蒸馏水混合均匀，置冰箱浸泡20h，加热煮沸20～30min，补足蒸发量，冷却至50℃～55℃，用纱布棉花过滤，调整pH值至6.6～6.8，分装于瓶中，121℃30min高压灭菌，置冰箱保存备用。

用途：用于配制鸡肉汤培养基，培养副鸡嗜血杆菌，制备传染性鼻炎菌苗。

③牛肉肝浸液（beef liver infusion）

成分：牛肉250g，牛肝250g，蒸馏水1000ml。

制法：除去脂肪、筋腱并绞碎的牛肉及切成小块并绞碎的牛肝加水混合均匀，置冰箱浸泡20～24h，取出后加热煮沸20～60min，补足蒸发水量，用纱布棉花过滤，滤液分装于玻璃瓶内，116℃20min高压灭菌，置冰箱保存备用。

用途：用于配制厌氧肉肝汤培养基，培养、保存和鉴定厌氧菌。

（2）植物组织浸液的制备方法

①黄豆粉浸液（soybean powder infusion）

成分：新鲜黄豆粉50g，氯化钠5g，纯盐酸1ml，蒸馏水1000ml。

制法：将上述成分放入适宜的容器内，搅拌均匀，在40℃～45℃水浴中保持20～24h，取出，于121℃20min高压灭菌，用白布过滤，滤液用碱调pH值至7.8，分装于玻璃瓶内，再于121℃20min高压灭菌，冷却后，置冰箱保存备用。

用途：作一般培养基的基础液，亦可代替牛肉浸液。

②豌豆粉浸液（pea powder infusion）

成分：豌豆粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。

制法：将上述成分放入适宜的容器内，搅拌均匀，加热煮沸1h，用煮沸的水补足蒸发量，冷却后，置冰箱过夜。次日取出，虹吸上清液，如不急用，应分装于玻璃瓶内，于121℃30min高压灭菌，冷却后，置冰箱保存备用。

用途：主要用于配制血琼脂、巧克力琼脂及亚硒酸盐琼脂等基础培养基。

（3）微生物细胞浸液的制备方法：微生物细胞浸液主要有酵母浸液（yeast infusion），以下以酵母浸液为例介绍其制备。

成分：新鲜啤酒酵母100g，蒸馏水400ml。

制法：将上述成分放入适宜的容器内，搅拌均匀，调节pH值至4.6，于沸水浴中加热10min，取出，过滤或离心，调节滤液pH值至7.0，过滤除菌，置冰箱保存备用。

用途：配制酵母浸液琼脂。

4.盐类：一般加入氯化钠或磷酸盐等以供给灰分元素营养。磷酸盐等则有缓冲作用。可维持培养基pH值的稳定；氯化钠则常兼作调节渗透压作用。

5.糖类、醇类糖类和醇类等：包括多种，常用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇等供微生物作碳源，以观察其利用和发酵反应情况。

（二）特殊需要的物质

常用血液、血清、腹水、组织碎粒、鸡蛋等物加入专用培养基中，以提供特殊的碳、氮和生长辅助因素营养，满足某些微生物的特殊需要。

（三）附加物质

1.琼脂：俗称“洋菜”，是从海藻中提制出的一种半乳糖硫酸酯。它在98℃时能溶化于水，温度降至45℃以下时则重新凝成凝胶状。琼脂在培养基中含量在1.5%以上时呈固体状态，在0.5%左右时呈半固体状态。一般微生物不能利用琼脂，它在培养基中只作固形剂用，以便分离与观察菌落特征。

2.明胶　系一种动物蛋白质，由动物的筋、腱等组织提制而得。它不溶于水，与水一起加热到25°C时即可溶化，冷却后可凝成凝胶。明胶的硬度很低，不能像琼脂那样作固形剂。一部分能产生胶原酶的细菌可使用胶液化。可用作微生物的生化特性鉴定。

3.指示剂　在培养基中加入适当的指示剂，可以观察pH值的变化或其他反应现象，从而显示培养过程中某些物质的利用和转化情况。常用的指示剂有酚红、碱性复红、溴麝香草酚蓝等。

4.抑菌剂　在培养基中加入适当的抑菌剂，可以抑制其他杂菌的生长而有利于目的菌的生长，方便增菌、鉴别和分离作用。结晶紫、抗菌素、孔雀绿、煌绿、胆盐等都是常用的抑菌剂。

二、培养基的制备方法

配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、校正pH值、澄清过滤、分装、灭菌及检定等步骤。

（一）调配

按培养基处方准确称取各种成分，混悬于蒸馏水中。先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入蛋白胨等各种成分，以防蛋白胨粘附于瓶底，然后再用剩余的蒸馏水冲洗瓶壁。

（二）溶化

将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸汽溶化半小时，如在电炉上熔化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，应注意补足失去的水分。

制备大量培养基时，除玻璃容器外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热溶化，但不可用铜或铁锅，以免金属离子进入培养基中，影响细菌的生长。

（三）校正

pH值的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书），一般培养基须校正pH值至7.4～7.6。此外，亦有需要酸性或碱性培养基者，这与细菌对pH值的适应范围有关。应当指出的是培养基在高压灭菌后其pH值降低0.1～0.2，故校正时应比实际需要的pH值高0.1～0.2。

（四）过滤澄清

培养基配成后一般都有沉渣或混浊，需过滤澄清使其清晰透明方可使用，常用的过滤澄清方法有：

1.液体培养基　常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白少许（每1000ml培养基用1个鸡蛋白），加热100℃后保持60℃～70℃，40～60min，使其不溶性物质附于凝固蛋白而沉淀过滤除去，以免高压灭菌后再出现沉淀。

2.固体培养基　如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中间夹脱脂棉过滤；亦可采用自然沉淀法，即将琼脂培养基盛入铝锅或广口搪瓷容器内，以高压蒸汽103.43KPa 15min融化后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可得清晰的琼脂培养基。

（五）分装

根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管等。分装的量不宜超过容器的，以免灭菌时外溢。

1.基础培养基　应常贮存无菌的基础培养基，以便临时分装或配制鉴别培养基等。分装的量根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，便于应用。一般常分装于三角烧瓶或盐水瓶内，灭菌后待用。

2.琼脂斜面　分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度约为培养基长度的2/3。

3.半固体培养基　分装量约占试管长度的1/3，灭菌后趁热直立，待冷凝固。

4.高层琼脂　分装量约占试管长度的1/3。灭菌后直立凝固待用。

5.琼脂平板　将灭菌（或加热融化）后的培养基，冷至50℃左右，以无菌手续倾入灭菌平皿内，内径9cm的平皿倾注培养基13～15ml，轻摇平皿底部，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成。倾注培养基时，切勿将平皿盖全部启开，以免空气中的尘埃及细菌落入平皿。

新制成的平板培养基（简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倾扣搁置于37℃培养箱内约30min，待平板表面干燥后使用。

（六）灭菌

1.高压蒸汽灭菌法　高压蒸汽灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别，一般培养基少量分装时高压灭菌103.43kPa 15min即可，培养基分装量较大时，可高压灭菌103.43kPa 30min。含糖的培养基高压灭菌55.16kPa 15min以免糖类被破坏。

2.流通蒸汽灭菌法　凡不耐高温的物质，如糖类、明胶、血清、牛乳及鸡蛋等培养基的灭菌，可用流通蒸汽灭菌，温度通常是100℃，加热15～30min，可杀死细菌繁殖体。

3.血清凝固器灭菌　含血清、鸡蛋的培养基，可用血清凝固器进行间歇灭菌，于第一天加热至75℃维持30min；第二天80℃30min；第三天85℃30min，每次灭菌完后取出培养基放在37℃温箱中培养一夜，第二天再灭菌，连续3次即可达到灭菌目的。最后放冷暗处或冰箱中保存备用。

4.水浴低温灭菌法：此法较为少用，是将用血清、腹水、组织液等配制的培养基在水浴中加热56℃～57℃，维持1h，以保持呈液体状态，连续5～9d水浴灭菌。

此外，尚有过滤除菌法，可用于糖溶液、尿素液、血清、腹水及其他因加热即破坏的物质，可用滤菌器过滤除菌。

（七）检定

检定即对培养基质量的检查。每批培养基制成后必须经检定后方可使用，检定时将培养基置37℃温箱内培养24h后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上的生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。

（八）保存

制好的培养基，通常不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批培养基均应注明制作日期，平日少量分装的试管培养基均宜存放在4℃冰箱内，其他基础培养等可保存于冷暗处。