实验二 细菌的人工培养
实验目的
1．了解培养基的制备程序和常用培养基的种类。
2．初步掌握细菌的接种方法。
3．了解细菌在培养基上的生长现象。
实验内容和方法
一、常用培养基的制备（示教）
1．制备程序 培养基各成分→混合熔化→测定及矫正pH→滤过→分装→灭菌→备用。
2．常用培养基
（1）基础培养基：普通肉汤培养基、普通琼脂培养基和半固体培养基的成分及用途。
（2）营养培养基：血液琼脂培养基（血平板）、血清肉汤培养基的成分及用途。
另外还有选择培养基（麦康凯琼脂培养基）、鉴别培养基（糖发酵管）、厌氧培养基（疱肉培养基）。
二、细菌接种法（示教）
1．平板划线接种法 主要用于细菌的分离培养。
（1）右手持接种环，在酒精灯火焰上灭菌，待冷，挑取混合葡萄球菌与大肠埃希菌的菌液1环。
（2）左手持普通琼脂平板，以拇指和食指开启平皿盖，并与平皿底不能超过45°。
（3）将挑取的菌液轻轻涂在平板边缘，接种环烧灼灭菌，待冷后接种环与平皿底平面保持30°～45°的角度，从涂抹部位开始连续在第一区来回划线（第一区划线约占平皿表面1／4）。
（4）用左手大拇指与中指旋转平板约60°的角度，接种环烧灼灭菌，待冷却后，进行第二区划线，第二区划线与第一区划线开始相交2～3条，以后可不相交；烧灼接种环后用上述方法进行第三、四或第五次划线（实验图2－1）。
实验图2－1 细菌分区划线接种法
（5）接种完毕后，接种环灭菌，合上平皿盖，在平皿底部做好标本记录（名称、标本号、日期等）。将平皿倒置放37℃培养箱中培养18～24小时。
（6）注意事项：划线接种时，力量要适中，切勿划破平板表面；划线要密而不重复，充分利用平板表面；严格无菌操作。
2．斜面培养基接种法 琼脂斜面培养基主要用作纯培养，保存菌种及细菌的生化反应观察。
（1）用左手食指、中指、无名指和大拇指握住斜面培养管。
（2）右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，并以右手的小指和手掌拔取管塞，将管口通过火焰灭菌。
（3）用灭菌接种环挑取细菌标本（大肠埃希菌），迅速伸入培养管斜面底部自下而上划一条直线，再由斜面底部向上轻轻蛇形划线。
（4）取出接种环，在火焰上灭菌管口，塞上管塞，灭菌接种环，将培养管做好标记，置37℃培养箱培养18～24小时。
3．液体接种法 液体培养基主要用于检查细菌的生化反应和增菌培养等。
（1）同斜面接种法左手握住肉汤管。
（2）右手持接种环（针），灭菌冷却后，以小指和手掌拔取管塞，将管口通过火焰灭菌。
（3）用接种环（针）挑取细菌标本（大肠埃希菌），伸入肉汤管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨，使细菌混入肉汤中。
（4）按无菌要求处理接种环（针）和试管口，塞上管塞，做好标记，置37℃培养箱中培养18～24小时。
三、细菌生长现象及代谢产物观察（示教）
1．细菌在培养基中的生长现象
（1）液体培养基：①浑浊生长（金黄色葡萄球菌）；②菌膜形成（枯草芽胞杆菌）；③沉淀生长（链球菌）。
（2）固体培养基：形成菌落和菌苔。注意观察菌落的大小、形态、透明度、颜色、湿润度、表面、边缘及菌落周围有无溶血环等。①金黄色葡萄球菌的菌落：圆形凸起、直径2～3mm、金黄色、湿润不透明、边缘整齐；②大肠埃希菌的菌落：圆形较大、灰白色、光滑、湿润。
（3）半固体培养基：用于观察细菌有无动力。①痢疾志贺菌无鞭毛，无动力，沿穿刺线生长，穿刺线四周培养基透明澄清；②大肠埃希菌有鞭毛，有动力，沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线模糊，四周浑浊呈雾状。
2．细菌代谢产物观察 糖发酵试验：将大肠埃希菌分别接种到葡萄糖及乳糖发酵管中，再将伤寒沙门菌分别接种到葡萄糖及乳糖发酵管中，置37℃培养箱中培养18～24小时后观察结果。大肠埃希菌既能分解乳糖，又能分解葡萄糖产酸产气，使培养基变成黄色，倒置小导管中有气泡，用符号“＋”表示；伤寒沙门菌分解葡萄糖只产酸不产气，培养基变黄，导管中无气泡，用“＋”表示；伤寒沙门菌不分解乳糖，发酵管不变色，导管中无气泡，用“－”表示。
记录细菌在培养基上的生长现象及糖发酵试验的结果。
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