培养基的配制及灭菌技术

培养基的配制及灭菌技术_现代微生物学实验

实验三　培养基的配制及灭菌技术

一、实验目的

（1）学习掌握各种培养基的配制原理与方法。

（2）掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理

培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等，并需调整在一定的酸碱度范围之内。由于微生物种类繁多，营养类型各异，加上实验和研究目的的不同，所以培养基的种类也很多。不同微生物对pH要求不同，配制培养基时，要根据不同微生物对pH的要求，将培养基的pH调至合适的范围。

本实验通过配制适用于细菌生长和分离的牛肉膏蛋白胨培养基，适用于放线菌生长和分离的高氏Ⅰ号培养基，用于霉菌生长和分离的麦芽汁天然培养基，使学生学习和掌握配制常用培养基的基本原理和方法。

灭菌是指杀死一定环境中所有微生物。微生物实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理都是通过加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。本实验要求学生学习和掌握培养基高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。

三、实验材料及仪器

（一）溶液和试剂

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、琼脂、1mol／L氢氧化钠、1mol／L的盐酸、可溶性淀粉、麦芽、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、碘液。

（二）材料及器具

烧杯、锥形瓶、培养皿、试管、移液管、漏斗、玻璃棒、量筒、天平、药匙、称量纸、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、恒温水浴锅、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、电炉、石棉网、试管架等。

四、实验步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备

培养基配方：

（1）称量：按上述培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏用玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品。

（2）熔化：上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂（琼脂用量1．5%到2%）溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。

（3）调pH：先用pH试纸测量上述定容后的培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol／LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．4～7．6。反之，则用1mol／LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

（4）分装：根据实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角烧瓶内。

①液体分装：分装高度以试管高度的1／4左右为宜。分装三角瓶的量一般不超过三角瓶容积的1／2。

②固体分装：装液量不超过试管高度的1／5，灭菌后摆斜面。分装三角瓶的量同液体分装一样。

③半固体分装：分装试管一般以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直放置凝固。

（5）加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口塞上试管塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保持良好的通气性能。

（6）包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在试管塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿试管塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

（7）灭菌：将上述培养基以1．05kg／cm2（15磅／英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

（8）搁置斜面：试管培养基冷却至50℃左右时，将试管塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

（9）无菌检查：将完成灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

（二）高氏Ⅰ号培养基的制备

培养基配方：

（1）称量和溶化。按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量并置于沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分硫酸亚铁可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

（2）pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查。同上述牛肉膏蛋白胨培养基的制备。

（三）麦芽汁培养基的制备

培养基配方：

（1）大麦芽的糖化。称取大麦芽100g，粉碎，加入400mL 60℃左右的热水。置于55～60℃的水浴锅中，保温使其自行糖化3～4小时。间歇搅拌，直至无淀粉反应为止（取上述少许溶液加入碘液2滴，如无蓝紫色出现，即糖化完全）。

（2）麦芽汁的制备。上述麦芽糖化液用纱布过滤，除去残渣，煮沸后再反复用脱脂棉或滤纸过滤，即得澄清麦芽汁（350～400mL，15～18Bé）。加水稀释成约10Bé的麦芽汁。

（3）麦芽汁培养基的制备。按配方量取麦芽汁，加入琼脂，加热溶解，待完全溶解后，加水到所需体积。

（四）培养基的高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是最常用的灭菌方法，其在高压蒸汽灭菌锅中进行。实验室采用的有全自动或非自动卧式高压蒸汽灭菌锅，也有手提式小型灭菌锅。现以手提式灭菌锅为例，介绍高压蒸汽灭菌的操作方法。其步骤为：

（1）取出内层锅，加水入外层锅内，水面与搁架相平即可。

（2）放回内层锅，装入待灭菌物品，上面遮一张防水纸。

（3）盖上锅盖时，将排气管插入内层锅的排气槽内，以对称方式旋紧螺栓。

（4）打开排气阀，通电加热使水沸腾并排气。待锅内冷空气完全排尽，关上排气阀，使温度随蒸汽压力增高而上升。

（5）待锅内蒸汽压升至所需压力时，控制热源，维持此压力至所需时间。

（6）切断电源，使锅内温度自然下降。待压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品。

五、思考题

（1）培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？

（2）在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题，为什么？

（3）你配制的高氏Ⅰ号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。

（4）怎样检查麦芽汁培养基是否完全糖化？

参考文献

［1］刘志恒．现代微生物学［M］．北京：科学出版社，2002．

［2］沈萍．范秀容，李广武．微生物学实验［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．

［3］杨文博．微生物学实验［M］．北京：化学工业出版社，2004．

［4］黄秀梨．微生物学实验指导［M］．北京：高等教育出版社，1999．

课后阅读

传统的高温杀菌，例如高温短时杀菌、高温瞬时杀菌等，原理都是通过高温杀灭微生物。但是高温处理会造成一部分热敏性营养成分被破坏。另外杀菌后，死亡的菌体还残留在体系中，可能造成不利影响。因此微孔滤膜过滤技术逐渐成为一项常用的除菌方法。使用时可根据需要，选用不同的滤膜。目前微孔滤膜的种类主要有。

（1）再生纤维素膜。天然纤维素经化学处理后重新成形，化学本质仍为多糖类物质。能耐受热压灭菌的高温，可经受各种有机溶剂的处理，不能在水介质中使用。在必须处理少量含水过滤液时，为防止过度膨胀，应先将膜置于滤器中用酒精抽紧再用，可减少变形。

（2）纤维素酯膜。是目前使用最多的一类微孔滤膜，性能优良，成本较低。能耐受热压灭菌，亲水性强，孔径均匀。主要有以下三类：

①醋酸纤维素膜。不吸附蛋白质、核酸等生物分子，滤速好，膜的贮藏和使用安全。

②硝酸纤维素膜。可耐受各种烃类、高级醇、氯化烃（除氯甲烷以外）的处理。在中等离子强度的条件下（如0．15mol／L）能结合单链DNA。

③混合纤维素酯膜。是醋酸纤维素和硝酸纤维素的混合膜，能耐受稀酸、稀碱、醚类、醇类、烃类及非极性氯代烃等，还可过滤－200℃的超低温液体，不能在冰乙酸、乙酸乙酯及丙酮介质中操作。能结合DNA双链及蛋白质与DNA的复合物。

（3）聚四氟乙烯膜。化学性质极为稳定，可耐受强酸、强碱、强氧化剂、各种腐蚀性液体和各种有机溶剂，工作温度范围也大，为－180～250℃。

（4）聚氯乙烯膜。物理、化学稳定性及憎水性均不及聚四氟乙烯膜，能耐受较强的酸和碱，不耐高温，工作温度不能超过65℃。消毒只能使用酒精、2%～3%甲醛、0．1%硫柳汞等。

（5）超细玻璃纤维滤膜。由玻璃纤维、玻璃粉经聚丙烯酸胶黏剂黏结而成，多用于处理气体介质，亦称为“空气超净过滤纸”。该类膜化学稳定性好，除氢氟酸及强碱外，能耐受各种化学试剂和有机溶剂，也不吸收空气中的水分，自身重量稳定性好，光学透过性亦佳，在许多有机溶剂中呈完全透明态。超细玻璃纤维滤膜的流速比一般微孔膜大，对颗粒的截留量也比微孔滤膜大，可以阻留98%以上比额定截留值大的颗粒。但截留分辨率不如微孔滤膜，故常与微孔滤膜配合使用，以提高过滤效率并延长微孔滤膜的使用寿命。广泛用于净化空气，也用于过滤光学测定溶液中的干扰颗粒（如圆二色谱分析及拉曼光谱分析）。在药物代谢或其他微量测定中，常用于收集细胞或沉淀，比离心法方便、可靠。超细玻璃纤维滤膜在收集同位素标记的生物高分子样品来测定软β－射线方面也表现出相当的优越性，在核酸研究领域可代替混合纤维素酯膜进行操作。

总体而言，微孔滤膜具备诸多优点：①设备简单，只需要微孔滤膜和一般过滤装置便可进行工作；②操作简单、快速，适于同时处理多个样品；③分离效率高，重现性好。因膜孔径比超滤膜大，流速大大加快，且可在同一片微孔膜上进行分离、洗涤、干燥、测定等操作，所以不会因样品转移而导致损失；④一些微孔滤膜具有结合生物大分子的特殊能力，根据这种选择结合作用建立的相应的结合测试分析方法，已经应用于基因工程等许多领域。