固定化细胞的生产

任务　固定化细胞的生产

细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，它免去了破碎细胞、提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶，因而固定化酶活力基本没有损失。此外，由于保留了胞内原有的多酶系统，对于多步催化转换的反应优势更为明显，而且无须辅酶的再生。但在选用固定化细胞作为催化剂时，应考虑到底物和产物是否容易通过细胞膜，细胞内是否存在产物分解系统和其他副反应系统，或者说虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或pH处理等相应的措施消除。

一、固定化细胞的制备

固定化细胞的制备方法有无载体法、吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。

1．无载体法

细胞可以在没有载体的情况下借助物理方法或化学方法将细胞直接固定化。这种固定化可以发生在细胞结构上，也可以通过细胞聚集来完成。例如微生物细胞可以通过加热、冰冻等物理手段进行固定化，也可以应用柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂和变性剂等处理达到固定化。这种处理的原理包括：使菌体内起破坏作用的蛋白酶等变性，防止目的酶被水解；使细胞结构固定，避免目的酶逸漏；使菌体聚集，促进较大的菌体颗粒形成。这些方法制备的固定化细胞一般只能用于完成单酶或少数几种酶催化的反应。例如白色链霉菌含有胞内葡萄糖异构酶，当在50℃以下保温时细胞会发生自溶，造成酶的渗出；但如果先在60～80℃加热处理10min，就会使发生自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶不会因为这种处理导致酶的明显失活。

除了上述物理方法、化学方法固定菌体外，也可以直接用霉菌孢子作为固定化细胞，这时孢子中的酶活力比菌丝体高3～10倍，而且可以长时间保存。

无载体法的优点是可以获得高密度的细胞，固定化条件温和，缺点是机械强度差。

2．吸附法

很多细胞都有吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力，这种吸附能力有的是天生具有的，有的是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力已经发展出许多价廉而又有效的固定化细胞的方法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂为载体，将细胞吸附到载体表面上使之固定化。

不同的载体要求的吸附条件不同，如用硅藻土或氢型皂土吸附时要求pH为3，而用氢型皂土吸附时要求pH为5。近年来，引起人们更多关注的是大孔陶瓷吸附剂，如英国国际陶瓷公司的C_l、C₂，其比表面积为4～25m²／g，每一颗粒有众多小孔，平均孔径为90 nm，便于细胞与营养物、底物、产物的接触和流动。另外，刀豆蛋白对细胞表面的糖蛋白具有专一的吸附作用，也可以用于细胞的固定化，成为一种新型的吸附剂，可以吸附啤酒酵母、假丝酵母等。

离子吸附法的原理是细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE－纤维素、CM－纤维素等。

吸附法的优点是操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及其酶活力。缺点是吸附容量小，结合强度低。

3．共价结合法

共价结合法是在细胞表面上的功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。有人用此法将卡尔酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上，虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿酐酸的活性。利用此法制备的固定化细胞，细胞大多死亡。

共价结合法的优点是细胞与载体之间的连接很牢固，使用过程中不易发生脱落，稳定性好；缺点是反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻。

4．交联法

交联法是指用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。交联法与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使细胞固定化，但交联法采用的是交联剂。如采用戊二醛或偶联苯胺等带有两个或两个以上的多功能团交联剂与细胞进行交联，可形成固定化细胞，但反应条件激烈，对细胞活性影响大。

5．包埋法

包埋法是将细胞定位于凝胶网格内的技术，是细胞固定化最常用的方法，按照包埋材料的结构可分为凝胶包埋和微胶囊包埋，即将细胞包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内。

常用的包埋材料为聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、胶原、纤维素等，其中聚丙烯酰胺应用得较早、较多。影响聚丙烯酰胺包埋效果的因素较多，如细胞与胶量比、丙烯酰胺单体比、聚合条件、聚合时间以及使用条件等。当菌体与胶量比为10%时，凝胶能够保留简单节杆菌的甾醇脱氢酶活力达40%，而上述比值小于5%时凝胶几乎不显示该酶的活力。

近年来，又发展了其他几类十分有用的包埋剂，如对Y射线等敏感的聚合胶、乙烯吡咯烷、聚乙烯醇、聚α－羟基丙烯酸等；对光敏感的交联聚合树脂、聚乙二醇丙烯酸酯（PEGM）以及聚氨甲酸乙酯衍生物等。PEGM两端的丙烯酰基对光具有敏感性，与酶液混合后，在光增敏剂存在下光照数分钟就可聚合得到固定化酶。这些物质包埋菌体都显著优于聚丙烯酰胺，因为聚丙烯酰胺单体能引起酶的失效。

包埋法的优点是细胞容量大，操作简便，酶的回收率高，制作的固定化细胞球的强度较高，目前被广泛应用；缺点是扩散阻力大，不适于催化大分子底物与产物的转化反应。

二、固定化方法与载体的选择

1．固定化方法的选择

酶和细胞的固定化方法很多，同一种细胞采用不同的固定方法，制得的固定化细胞的性质可能相同或相差甚远。不同的细胞也可以采用同一种固定方法，制得不同性质的固定化生物催化剂。因此细胞的固定化方法没有特定的规律可以遵循，需要根据具体情况和试验来摸索具体可行的方法。另外，如果是为了工业化应用，还必须考虑各种制备试剂的原材料的价格便宜易得和制备方法简便易行的原则。因此，应考虑下述几个因素来选择固定化的方法。

（1）固定化细胞应用的安全性

尽管固定化生物催化剂比化学催化剂更为安全，但也需要按照药物和食品领域的检验标准做必要的检查。因为除了吸附法和几种包埋法外，大多数固定化操作都涉及化学反应，必须了解所用的试剂是否有毒性和残留，应尽可能选择无毒性试剂参与的固定化方法。

（2）固定化细胞在操作中的稳定性

在选择固定化的方法时要求固定化细胞在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。因此应考虑细胞和载体的连接方式、连接键的多寡和单位载体的酶活力，从各方面进行权衡，选择最佳的固定化方法，以制备稳定性高的固定化细胞。

（3）固定化的成本

固定化成本包括细胞、载体和试剂的费用，也包括水、电、气、设备及劳务投资。如细胞、载体及试剂价格较高，但由于固定化细胞能长期反复使用，提高了细胞的利用率，也比原工艺优越。即使固定化成本不低于原工艺，仅对原工艺有较大改进，或可简化后处理工艺，提高产品质量和收率，节省劳务，那么该固定化方法就仍有实用价值。

2．固定化载体的选择

载体最好是选择已在其他工业生产中大量使用的材料，这在经济上会有好处。理想的固定化载体应具有无毒性、传质性能好、性质稳定、寿命长、价格低廉等特性。如海藻酸钠、聚乙烯醇等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等也都是有应用前途的载体。

三、固定化细胞的形状与性质

1．固定化细胞的形状

由于细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，两者在许多方面都相同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等。用无载体法制备的为粉末状的固定化细胞。固定化细胞的方法主要是包埋法，其次是交联法或二者相结合的方法。工业上应用最多的就是用包埋法制备各种形状的固定化细胞。

2．固定化细胞的性质

细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH、最适温度和K值的变化基本上与固定化酶相仿。细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。

固定化细胞按其生理状态可以分为死细胞和活细胞两大类。固定化的细胞在形态学上一般没有明显变化，但用扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。

固定化死细胞在固定化之前经过物理或化学手段处理，目的在于增加膜的通透性，抑制副反应发生，适合于单酶催化反应，其固定化以后的性质类似于固定化酶的性质变化。

固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化以后细胞是活的，但采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，处于休眠或饥饿状态。

固定化增殖细胞是将活细胞固定在载体上，可以在连续的反应过程中保持旺盛的生长繁殖能力。从理论上讲只要载体不解体、不污染，就可以长期使用。以基因工程菌为例，固定化的工程菌比游离菌稳定性好。

细胞固定化后，最适pH的变化无特定规律，如聚丙烯酰胺凝胶包埋的大肠杆菌（E．coli）（含天冬氨酸酶）和产氨的短杆菌（含延胡索酸酶）的最适pH与各自游离的细胞相比，均向酸侧偏移；但用同一种方法包埋的无色短杆菌（含L－组氨酸脱氨酶）、恶臭假单胞菌（含L－精氨酸脱亚氨酶）和大肠杆菌（含青霉素酰胺酶）的最适pH均无变化。因此可选择适当的固定化方法处理相应的细胞，使其最适pH符合反应要求。

细胞被固定化后，最适温度通常与游离细胞相同，如用聚丙烯酰胺凝胶包埋的大肠杆菌（含天冬氨酸酶、青霉素酰胺酶）和液体无色杆菌（含L－组氨酸脱氨酶），最适温度和游离细胞相同，但用同一方法包埋的恶臭假单菌（含L－精氨酸脱亚胺酶）的最适温度却提高20℃。

固定化细胞的稳定性一般都比游离细胞高，如含天冬氨酸酶的大肠杆菌用精三醋酸纤维素包埋后，用于生产L－天冬氨酸，于37℃连续运转两年后，仍保持原活力的97%；用卡拉胶包埋的黄色短杆菌（含延胡索酸酶）生产L－苹果酸，在37℃连续运转一年后，其活力仍保持不变。由此可见，细胞的固定化具有广阔的工业应用前景。

3．固定化酶活力的测定方法

固定化酶具有两个基本反应系统，即填充床反应系统和悬浮搅拌反应系统。因此，根据固定化酶的反应系统，其活力的测定可以分为分批测定法和连续测定法两种。

（1）分批测定法

分批测定法是固定化酶在搅拌或振荡的情况下进行测定的方法，与测定天然酶的方法基本一致，即间隔一定时间取样，过滤后按常规测定，方法比较简便。但测定结果与反应器的形状、大小和反应液的数量有关，同时也与搅拌和振荡的速度有关，速度加快，活力上升，达到一定程度后活力不再改变。但若搅拌过快会导致固定化酶破碎成更小的细粒而使酶的活力升高，因此测定过程中应严格控制反应条件，否则无可比性。

（2）连续测定法

不管是分批反应器还是连续搅拌反应器或填充床反应器，都可以从其中引出反应液到流动比色杯中进行分光光度测定。在连续搅拌反应器中，可以根据底物的流入速度和反应速度之间的关系来计算酶的活力，但反应器的形状可能影响反应速度。除分光光度法外，也可以在缓冲能力弱的情况下用自动pH滴定仪来测定质子的产生与消耗过程，或者通过测定反应过程中氧气、NH3、电导和旋光的变化来确定酶的活力。